溶酶体代谢酶甘露糖-6-磷酸糖基化修饰关键酶UCE的异源表达及功能鉴定

摘要

目的 利用大肠杆菌表达系统对溶酶体代谢酶甘露糖-6-磷酸(M6P)糖基化修饰的关键酶N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸二酯α-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶(UCE)进行异源表达和功能鉴定。方法 通过UCE的氨基酸序列分析,分别截去UCE的信号肽、前体肽、跨膜区、胞浆尾肽等结构域,形成不同形式的截短型UCE。利用促溶标签麦芽糖结合蛋白(MBP)的载体和大肠杆菌表达系统,对不同的截短型UCE进行表达。将表达的可溶性融合蛋白利用Ni离子琼脂糖凝胶进行亲和层析纯化,并利用UDP-Glo试剂盒测定融合蛋白的活性。结果 截短型的UCE-MBP融合蛋白能够被可溶性地融合表达,并且能够利用Ni离子琼脂糖凝胶进行亲和层析纯化。去掉其前体肽和仅保留核心区的UCE融合蛋白能够展现出较高的活性。结论 利用促溶标签蛋白能够实现UCE在大肠杆菌中可溶性地融合表达,从而能够快速制备大量的UCE,该酶可用于对溶酶体代谢酶体外糖基化的生物催化修饰。