外基质激活ERK信号通路促进成纤维细胞增殖及膝关节术后的纤维化

摘要

背景:关节纤维化是关节手术的严重并发症之一,目前认为外基质对纤维化的发生至关重要,然而其发生机制尚不明确.目的:探究外基质在膝关节术后纤维化中的作用及体外对成纤维细胞增殖能力的影响.方法:①体内实验:取12只新西兰大白兔构建下肢膝关节粘连模型,术后2,4周取材,分别进行苏木精-伊红染色、马松染色、天狼猩红染色、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)免疫组织化学染色,分析外基质对膝关节术后纤维化的影响.②体外实验:构建成纤维细胞来源的外基质与脱细胞外基质,共聚焦三维成像下检测外基质厚度.将成纤维细胞分别进行脱细胞外基质三维培养与二维培养,利用细胞膜染色、细胞快速黏附实验评估脱细胞外基质功能,利用细胞计数、EdU实验、细胞周期与Western blot检测评估脱细胞外基质对细胞增殖的影响,同时检测ERK信号通路蛋白表达.结果与结论:①体内实验:苏木精-伊红、马松、天狼猩红染色显示,术后4周的关节纤维化程度加重,纤维化组织中外基质主要成分胶原合成增加,天狼星红染色显示胶原构成主要是Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白.免疫组织化学染色显示,术后4周纤维化组织中的成纤维细胞数量及PCNA蛋白水平增加.②体外实验:外基质厚度>10μm.细胞膜染色显示,三维培养的成纤维细胞呈现纺锤形,二维培养的细胞形态不规则.快速黏附实验显示,三维培养的细胞黏附数量约是二维培养的6倍(P<0.05).细胞计数、EdU实验、细胞周期分析显示,三维培养的成纤维细胞增殖快于二维培养(P<0.05).Western blot检测显示,三维培养的PCNA、Cyclin D1及p-MEK、p-ERK蛋白表达高于二维培养(P<0.05).③结果表明,外基质可能是通过激活ERK信号通路促进成纤维细胞的增殖及膝关节术后纤维化粘连的发生.