分离培养方法及冻存技术对犬骨髓间充质干细胞生长和增殖的影响

摘要

背景:骨髓间充质干细胞在体外长期培养易发生自发分化,而失去多分化潜能,因此必须对培养的细胞及时冻存,需要时再进行复苏。目的:建立犬骨髓间充质干细胞体外分离、培养、增殖、冻存的方法。设计、时间及地点:对照观察细胞学实验,于2005-06/2008-06在浙江中医药大学附属第一医院骨伤研究所完成。材料:健康成年雄性Beagle犬用于骨髓间充质干细胞的提取。方法:采用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化骨髓间充质干细胞,并进行传代扩增培养。将第2代骨髓间充质干细胞与12.5%DMSO混匀置于冻存管中,采用慢冻快融法进行冻存和复苏:将冻存管置于-4℃冰箱2h,然后移入-30℃冰箱2h,再置于厚壁塑料泡沫盒中,扎紧密封,置-80℃冰箱过夜后,取出冻存管直接放入液氮中保存,或放入-80℃冰箱保存。复苏时将冻存管从液氮或-80℃冰箱中取出,立即置37℃水浴并轻轻摇动,1～2min内迅速解冻。主要观察指标:复苏前后细胞成生长活性及形态变化。结果:分离的骨髓间充质干细胞为以均一的梭形的成纤维细胞样贴壁生长,贴壁及增殖能力强,传代细胞贴壁较快。经过液氮长期冻存后,将复苏后的骨髓间充质干细胞再培养,细胞形态及生长状态与冻存前无差异,均呈长梭形均匀分布生长,细胞生长增殖旺盛。结论:采用密度梯度离心法结合贴壁培养法可获得犬骨髓间充质干细胞,应用慢冻快融技术进行冻存和复苏,较好的保持了冻存细胞的活力和功能。