昆明小鼠胚胎干细胞的分离培养方法

摘要

背景：目前已经建立了数百个小鼠的胚胎干细胞系，这些细胞系大多数来源于129，C57BL/6J和BALB/C品系的小鼠，而昆明株小鼠的胚胎干细胞建系的成功率很低。目的：探寻昆明小鼠胚胎干细胞分离培养的方法，以期提高昆明小鼠胚胎干细胞建株的成功率。设计、时间及地点：以细胞为对象的观察性实验，于2006—04/2007—06在重庆市神经病学重点实验室完成。材料：昆明白小鼠3．5d和4d胚龄的囊胚。方法：分别将昆明白小鼠3．5d和4d胚龄的囊胚培养在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上，四五天后取隆起生长的内细胞团块分离后再培养，分别采用2．5g/L胰蛋白酶-0．4g/L乙二胺四乙酸与1g/L胰蛋白酶-0．2g/L乙二胺四乙酸室温作用2～4min并辅以机械离散胚胎干细胞集落。主要观察指标：观察集落的生长情况，通过碱性磷酸酶染色、OCT-4染色、细胞核型分析等对细胞集落进行鉴定。结果：①4d胚龄胚胎的贴壁率、内细胞团出现率及克隆形成率高于3，5d胚龄（P〈0．05）。②采用1g/L胰蛋白酶-0.2g/L乙二胺四乙酸室温作用2～4min并辅以机械作用，分离克隆胚胎干细胞效果较好。③胚胎干细胞呈集落性生长，符合小鼠胚胎干细胞的一系列特性，悬浮培养胚胎干细胞能得到囊状胚体。结论：采用4d胚龄的囊胚和1g/L胰蛋白酶-0．2g/L乙二胺四乙酸室温作用2～4min，并辅以机械作用的消化方法，有助于提高昆明小鼠胚胎干细胞建株的能力。