骨形态发生蛋白2和音猬因子体外诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化

摘要

背景:研究表明,骨形态发生蛋白2和音猬因子联合诱导干细胞的定向分化存在理论上的可能性,但目前联合诱导间充质干细胞的方向纷繁复杂,且众说纷纭。目的:观察骨形态发生蛋白2和音猬因子在体外联合和单独应用促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的能力。设计、时间及地点:随机分组设计,对比观察,于2008-12在江苏大学临床医学院实验室完成。材料:6周龄SPF级SD大鼠10只,体质量140～160g,雌雄不拘,用于间充质干细胞的获得、培养和传代。重组人骨形态发生蛋白2、音猬因子为PeproTech公司产品。方法:将SD大鼠的间充质干细胞分离培养后分为4组:重组人骨形态发生蛋白2组:加入100mg/L重组人骨形态发生蛋白2;音猬因子组:加入20μg/L音猬因子;联合组:100mg/L重组人骨形态发生蛋白2联合20μg/L音猬因子作用于SD大鼠间充质干细胞;对照组:不加任何干预措施。主要观察指标:倒置相差显微镜观察细胞形态学的变化;MTT法检测细胞培养第3,6,9,12天细胞增殖数和细胞碱性磷酸酶活性;以及成骨细胞表型的检测和Ⅰ型胶原蛋白免疫印迹分析,以比较各组诱导成骨能力的差异。结果:①间充质干细胞培养24h后部分贴壁,贴壁细胞呈圆形或椭圆形,第7天左右细胞铺满瓶底,多为梭形。条件培养基培养3d后,联合组细胞由长梭形转变为多角形。随后重组人骨形态发生蛋白2组细胞发生成骨样改变,音猬因子组细胞未见明显形态学改变。②相同时间点联合组、重组人骨形态发生蛋白2组、音猬因子组细胞吸光度均高于对照组(P<0.05)。联合组和重组人骨形态发生蛋白2组在各时间点碱性磷酸酶表达量均高于音猬因子组和对照组(P<0.05)。③间充质干细胞经诱导培养7d后,碱性磷酸酶细胞化学染色联合组和重组人骨形态发生蛋白2组呈阳性,联合组可见胞质中棕黄色颗粒,音猬因子组和对照组阴性。诱导培养14d后,Ⅰ型胶原免疫荧光染色音猬因子组和对照组均为阴性,联合组和重组人骨形态发生蛋白2组为阳性,但联合组细胞数量明显增多,细胞间融合较好,重组人骨形态发生蛋白2组细胞融合欠佳。矿化沉积茜素红染色音猬因子组和对照组仍为阴性,联合组和重组人骨形态发生蛋白2组为阳性,联合组细胞间可见红色的钙结节。④蛋白免疫印迹分析显示,与对照组相比,联合组和重组人骨形态发生蛋白2组Ⅰ型胶原蛋白表达增加,联合组尤其明显,音猬因子组与之接近。结论:骨形态发生蛋白2和音猬因子在体外能明显促进间充质干细胞向成骨细胞分化并且具有明显的协同相关性。