环状RNA BICD2对口腔鳞状细胞癌细胞生物学行为的影响及机制研究

摘要

目的探讨环状RNA（circular RNA, circRNA）BICD2（circ-BICD2）对口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC）谷氨酰胺代谢、细胞增殖、迁移侵袭、凋亡的影响和可能机制。方法纳入2016年1月至2018年1月就诊于郑州大学第一附属医院口腔科, 手术切除的35例OSCC患者的肿瘤组织及其癌旁正常组织样本。通过实时定量PCR（real-time quantitative PCR, RT-qPCR）和蛋白质印迹法检测OSCC组织与癌旁组织、OSCC细胞（CAL27、SCC9、SCC15）与正常上皮细胞HIOEC细胞中circ-BICD2、miR-296-5p和转录球蛋白2（transgelin2, TAGLN2）的表达水平。生物信息学方法、双荧光素酶报告实验、RNA结合免疫沉淀反应（RNA binding protein immunoprecipitation, RIP）实验检测circ-BICD2与miR-296-5p、miR-296-5p与TAGLN2的靶向关系。在CAL27和SCC9细胞中分别转染circ-BICD2小干扰RNAsi-circ-BICD2#1（敲低1组）、si-circ-BICD2#2（敲低2组）及阴性对照si-NC（siRNA空白组）;在敲低1组细胞中分别转染miR-296-5p抑制物anti-miR-296-5p（抑制物组）及其阴性对照anti-miR-NC（抑制物对照组）。在CAL27和SCC9细胞中转染miR-296-5p模拟物（miR过表达组）及其阴性对照miR-NC（miR空白组）。在miR过表达组细胞中转染TAGLN2（共转染组）及空白质粒pcDNA（共转染对照组）。运用细胞计数试剂盒（cell counting kit 8, CCK-8）、集落形成实验、流式细胞术、划痕愈合实验、Transwell实验等检测OSCC生物学行为。同时检测谷氨酰胺（glutamine, gln）消耗量、α-酮戊二酸（α-ketoglutarate, α-KG）产生量和ATP浓度观察其对细胞代谢的影响。蛋白质印迹法检测各组CAL27和SCC9细胞中的细胞周期素D1（cyclinD1）和谷氨酰胺水解酶（glutamine hydrolase, GLS1）蛋白表达量。取4周龄清洁级BALB/c雌性裸鼠12只, 于腋下皮肤分别注射转染sh-circ-BICD2（敲低组）和sh-NC（对照组）后的SCC9细胞单细胞悬液, 建立移植瘤模型, 每组6只。注射32 d时断颈处死裸鼠并切除肿瘤, 检测肿瘤质量及两组的circ-BICD2、miR-296-5p及TAGLN2的表达水平。结果 OSCC组织中circ-BICD2、TAGLN2表达量（分别为2.54±0.71和1.86±0.15）显著高于正常组织（分别为1.00±0.35和1.00±0.11）, miR-296-5p表达量（0.56±0.23）显著低于正常组织（1.00±0.32）（P＆0.05）。敲低1组CAL27和SCC9细胞活力、克隆形成数、迁移率、侵袭细胞数、S期细胞比例、gln消耗量、α-KG产生量、ATP浓度、cyclinD1和GLS1蛋白表达均显著低于siRNA空白组, 细胞凋亡率、G0/G1期细胞比例显著高于siRNA空白组（P＆0.05）。与抑制物对照组相比, 抑制物组CAL27和SCC9细胞miR-296-5p表达显著降低, 细胞活力、克隆形成数、迁移率、侵袭细胞数、S期细胞比例、gln消耗量、α-KG产生量、ATP浓度、cyclinD1和GLS1蛋白表达均显著升高, 细胞凋亡率、G0-G1期细胞比例显著降低（P＆0.05）。与miR空白组相比, miR过表达组CAL27和SCC9细胞TAGLN2 mRNA、蛋白表达量均显著降低。与共转染对照组比较, 共转染组CAL27和SCC9细胞TAGLN2 mRNA、蛋白表达量均显著升高（P＆0.05）。动物实验结果显示, 与对照组相比, 敲低组裸鼠的肿瘤体积、质量、circ-BICD2及TAGLN2的表达水平均显著降低, miR-296-5p表达水平显著升高（P＆0.05）。结论 OSCC组织和细胞中circ-BICD2均为高表达, 干扰circ-BICD2可抑制OSCC细胞增殖、迁移侵袭、谷氨酰胺代谢以及肿瘤生长, 促进细胞凋亡, 其机制与调控miR-296-5p/TAGLN2分子轴有关。