舌鳞状细胞癌顺铂耐药细胞系细胞周期蛋白D1RNA干扰的体外研究

摘要

目的 用人工合成的耐药相关基因细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的小分子干扰RNA(siRNA)处理人舌鳞癌顺铂耐药细胞系(Tca8113-CDDP), 探讨对靶基因转录调控的作用效果以及剂量和时间效应关系,为耐药性逆转提供实验依据.方法 CY3荧光素标记阳性对照基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)siRNA,分别于转染后4、24、48、72 h在激光共聚焦显微镜下观察瞬时转染率, 优化转染条件.用SYBR绿色荧光染料法、实时定量PCR技术分析目的基因mRNA的表达情况,同时采用蛋白印迹(Western blot)检测目的基因蛋白水平的表达.四甲基偶氮唑盐法检测cyclin D1 siRNA处理后细胞对顺铂敏感性的影响.结果 优化转染条件后,Tca8113-CDDP细胞中CY3 的GAPDH siRNA转染率达90%以上.转染cyclin D1 siRNA 后24、48 h mRNA表达的抑制率为81.6%、80.7%,72 h最为明显,为94.3%.在低于100 nmol/L浓度下,RNA干扰抑制与剂量大小有关;当剂量进一步加大时,抑制效应则维持在"平台期".转染24、48和72 h 后,cyclin D1蛋白的表达也明显下降. siRNA干扰组和对照组细胞在顺铂作用后细胞生长抑制率分别为58.4%、34.8%.结论 化学合成的cyclin D1 siRNA在体外实验中,对Tca8113-CDDP细胞中目的基因的沉默提高了细胞对顺铂敏感性,并呈现剂量和时间依赖效应.