沉默Krüppel样因子5对电离辐射后大鼠小肠上皮IEC-6细胞生物学功能的影响

摘要

目的探讨沉默Krüppel样因子5（KLF5）对电离辐射后体外培养的大鼠小肠上皮IEC-6细胞生物学功能的影响。方法给予大鼠小肠上皮IEC-6细胞12 Gy照射,分别在照后0、0.5、1、2、3、5、7、24 h,检测KLF5的表达。给予IEC-6细胞0、2、4、8、12和16 Gy X射线照射,照后3 h收集细胞蛋白,采用Western blot法检测IEC-6细胞中KLF5的表达。设计并合成特异性针对大鼠KLF5基因的shRNA靶序列,构建到慢病毒载体中,通过感染人胚肾293T细胞,对慢病毒进行包装和滴度测定。使用包装好的慢病毒感染IEC-6细胞,荧光显微镜下观察转染效率,转染72 h后分别采用实时-PCR和Western blot方法检测感染后细胞中KLF5 mRNA及蛋白的表达。后续实验分为阴性对照组、shKLF5组、单纯照射组、照射+ shKLF5组4组。采用CCK-8法观察8 Gy照射后KLF5沉默细胞的增殖活性,流式细胞术检测8 Gy照射后KLF5沉默细胞的周期分布和凋亡,免疫荧光染色观察2 Gy照射后KLF5沉默细胞中γ-H2AX焦点数量。结果不同剂量射线照射后KLF5表达逐渐增加,呈现明显的剂量效应关系。12 Gy照射后KLF5表达呈现先升高后降低的趋势,照后5 h表达量最高。KLF5 shRNA慢病毒载体构建成功,感染的IEC-6细胞中KLF5 mRNA及蛋白水平均在转染72 h明显降低。照射+shKLF5组细胞在照射后24 h阻滞在G2/M期现象显著（t=11.56,P＆0.05）,细胞增殖明显受到抑制,其细胞凋亡率（12.49±0.63）%,明显高于单纯照射组（7.42±0.49）%,两组比较差异有统计学意义（t=10.98,P＆0.05）,照射+shkLF5组细胞核中各时间点的γ-H2AX焦点数量明显多于同一时间点阴性对照组（t=22.07、23.89、11.24、59.97、20.85,P＆0.05）。结论成功构建KLF5 shRNA慢病毒载体,并建立KLF5敲低小肠上皮细胞株。下调细胞内KLF5表达,能够使细胞周期阻滞在G2/M期,抑制照射后细胞的增殖,促进细胞的凋亡,DNA双链断裂水平增加,修复延迟。