以色列急性麻痹病毒Taq Man荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

摘要

为建立以色列急性麻痹病毒(IAPV)荧光定量RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank中IAPV RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)基因保守区域序列设计了一对特异性引物和一条特异性探针,以体外转录制备的重组质粒标准品为模板,经过反应条件优化,建立了IAPV荧光定量RT-PCR检测方法,并对其进行了特异性、敏感性、重复性试验;利用所建立的方法对70份福建地区临床疑似IAPV感染的蜜蜂样品进行检测,并对阳性样品进行测序验证。结果显示,荧光定量RT-PCR方法的最佳引物和探针浓度分别为0.25μmol/L和0.20μmol/L,最佳退火温度为61℃。该方法仅对IAPV出现阳性扩增信号,对蜜蜂克什米尔病毒、蜜蜂慢性麻痹病毒、蜜蜂残翅病毒、蜜蜂急性麻痹病毒、蜜蜂黑蜂王台病毒、蜜蜂囊状幼虫病毒等6种病毒均未出现扩增,特异性较强;该方法对重组质粒标准品的最低检测限为9.7拷贝/μL,比普通RT-PCR敏感性高约100倍;该方法批内及批间变异系数均小于1.5%,重复性好。利用该方法和普通RT-PCR方法分别对70份临床样品进行检测,结果显示,两种方法的阳性检出率分别为31.4%(22/70)和27.1(19/70),二者的符合率为95.9%。本研究首次建立的IAPV Taq Man荧光定量RTPCR检测方法快速、敏感,检测结果准确可靠,为IAPV的流行病学调查及其分子生物学的快速检测奠定了基础。