单核细胞增生李斯特菌RsbS蛋白的抗应激机制作用研究

摘要

为了研究单核细胞增生李斯特菌(Lm)RsbS蛋白的抗应激机制,本研究设计针对rsbS基因完整ORF的引物,PCR扩增rsbS基因,构建重组表达质粒pET-30a-rsbS,转化至表达菌株Rosetta(DE3)中,经IPTG诱导培养后SDS-PAGE检测,结果显示获得18.8 ku带His标签的重组RsbS蛋白,利用His-Ni纯化柱纯化重组RsbS蛋白,得到浓度约1μg/mL的纯化蛋白。以纯化的重组RsbS蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,经间接ELISA测定抗体效价为1:128 000;经western blot检测RsbS多克隆抗体具有良好的反应原性。通过等温滴定量热试验检测与RsbS互作的蛋白,结果显示RsbS与其上游RsbR蛋白存在体外互作。将Lm野生株10403S和缺失株ΔrsbR分别接种至BHI液体培养基和含5%NaCl的BHI应激培养基培养后,分别采用荧光定量PCR和western blot对rsbS的转录和表达水平进行分析,结果显示经5%NaCl应激30 min后,野生株中rsbS的转录和表达水平增高,而缺失株中rsbS的转录和表达水平均降低。综上,本研究首次证实RsbS通过与RsbR蛋白互作参与Lm的抗应激反应。本研究为进一步揭示RsbS蛋白的生物学功能及Lm的抗应激机制研究奠定基础。