CpG甲基转移酶诱导紧密连接蛋白7和8基因表达下调对人结肠癌HT-29细胞增殖和凋亡的影响

摘要

目的探讨CpG甲基转移酶M.SssI对人结肠癌HT-29细胞中紧密连接蛋白7（claudin-7）和claudin-8表达的调节作用,及其对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法以50 U/ml的M.SssI处理HT-29细胞24 h（过甲基化组）,采用重亚硫酸盐测序法检测claudin-7和claudin-8基因启动子区域CpG岛的甲基化状态,实时荧光定量PGR法检测claudin-7和claudin-8 mRNA的表达,细胞免疫荧光技术和Western blot法检测claudin-7和claudin-8蛋白的表达,Hoechst 33342荧光染色法和流式细胞术检测HT-29细胞的凋亡,四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测HT-29细胞的增殖。同时设对照组（以2μl PBS处理HT-29细胞）和5-Azacytidine组（以10μnol/L 5-Azacytidine处理HT-29细胞）。结果过甲基化组claudin-7和claudin-8靶序列中发生甲基化的CpG胞嘧啶数目分别为25和10个,对照组分别为9和5个,5-Azacytidine组分别为0和3个。过甲基化组claudin-7和claudin-8mRNA和蛋白的表达均明显低于对照组（均P＜0.05）,而5-Azacytidine组claudin-7和claudin-8mRNA和蛋白的表达均明显高于对照组（均P＜0.05）。Hoechst 33342荧光染色结果显示,对照组和5-Azacytidine组的HT-29细胞均呈均匀蓝色荧光,细胞呈圆形,大小一致,无明显差异;而过甲基化组HT-29细胞呈高度白色荧光的凋亡细胞明显增多。流式细胞术检测结果显示,过甲基化组HT-29细胞的早期凋亡率比对照组增加84.7%（P=0.002）。MTT法检测结果显示,过甲基化组HT-29细胞的生长速度较对照组缓慢（P=0.002）,HT-29细胞的增殖抑制率为32.1%;5-Azacytidine组HT-29细胞的增殖水平与对照组相似（P=0.084）。结论 CpG甲基转移酶可以通过上调claudin-7和claudin-8基因启动子区的甲基化程度,下调HT-29细胞中claudin-7和claudin-8 mRNA和蛋白的表达,从而诱导细胞产生凋亡,并抑制其增殖。