单核细胞增生李斯特菌毒力基因aroA启动子上阻碍PrfA转录调控元件的研究

摘要

目的研究食源性致病菌单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes,简称LM）毒力基因启动子的结构特点及其与转录调控因子PrfA（positive regulatory factor A）蛋白之间的关系.方法选取plcA和aroA两个毒力基因启动子作为研究对象,plcA基因启动子（PplcA）上含有一个高度保守的PrfA蛋白结合序列TYAACAAATGTFAA（PrfA-box）和-10区（TAAGAT）,其转录表达受PrfA强调控;aroA基因不受PrfA调控,所利用的启动子ParoA1为非依赖于PrfA的肩动子,但是在紧邻ParoA1的下游区域却含有一个与PplcA相似的PrfA-box（TTAAAACATGTTAA）和一个-10区（TTTAAT）,该区域疑似为依赖于PrfA的启动子,被命名为ParoA2.应用PCR定点突变和SOEing PCR（重叠区扩增基因拼接法）技术互换了PplcA和ParoA2上可能影响PrfA蛋白结合以及诱发转录起始相关的碱基序列,构建了一系列PplcA-ParoA2杂合突变启动子,并插入到无启动子的lacZ报告基因上游,使lacZ基因的表达置于突变启动子下.获得的启动子融合表达质粒分别电转化入LM野生株P14、PrfA蛋白高表达突变株Pl4a和prfa基因等位缺失突变株A42中,检测相应的β-半乳糖苷酶活性以确定杂合突变启动子是否具有依赖PrfA的转录活性及其水平高低.结果当肩动子上影响PrfA转录调控的两个核心元件PrfA-box与-10区的距离保持在最适的22或23个碱基时,交换PplcA和ParoA2上的两个相应核心元件的碱基序列并不改变启动子的转录活性.但是,当PplcA上的两个核心元件之间的碱基以及-10区下游的序列被相应ParoA2上的序列所替代后,PplcA依赖于PrfA的转录活性完全丧失,反之,ParoA2上的这两段序列如果被PplcA的序列所替换,ParoA2则表现出依赖于PrfA的转录活性.结论 ParoA2的-10区及其下游的序列可能形成发夹结构,阻碍RNA聚合酶-PrfA蛋白复合物结合到解旋的单链模板DNA上生成具有转录起始活性的开放复合物,从而抑制了ParoA2依赖于PrfA的转录活性的表达。