CLC-2氯离子通道靶向阻滞对人结膜成纤维细胞纤维化的抑制作用及其机制

摘要

目的探讨CLC-2氯离子通道靶向阻滞对人结膜成纤维细胞(HConF)纤维化过程的抑制作用。方法将HConF分为空白对照组、脂质体2000(Lipo2000)组、无义小干扰RNA(siRNA)组和CLC-2 siRNA转染组,其中空白对照组不做任何处理,其他各组分别采用含有相应转染试剂的培养基培养。采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞中CLC-2 mRNA的表达水平;采用CCK-8试剂盒检测各组HConF的增生能力,即吸光度(A)值;采用流式细胞仪检测各组HConF凋亡比例;采用细胞划痕实验和Transwell迁移实验检测各组HConF迁移能力;采用胶原收缩实验检测各组胶原面积收缩率;采用Western blot法检测各组细胞胶原蛋白(Collagen)Ⅰ、CollagenⅢ、PI3K、Akt、p-PI3K和p-Akt的蛋白表达水平。结果空白对照组、Lipo2000组、无义siRNA组和CLC-2 siRNA转染组CLC-2 mRNA相对表达量和细胞A值总体比较差异均有统计学意义(F=90.110、198.680,均P<0.001),其中CLC-2 siRNA转染组CLC-2 mRNA相对表达量和细胞A值明显低于无义siRNA组,差异均有统计学意义(均P<0.001)。空白对照组、Lipo2000组、无义siRNA组和CLC-2 siRNA转染组细胞凋亡率分别为(4.78±1.10)%、(4.54±1.51)%、(4.82±0.88)%和(28.90±0.91)%,总体比较差异有统计学意义(F=363.260,P<0.001),其中CLC-2 siRNA转染组细胞凋亡率明显高于无义siRNA组,差异有统计学意义(P<0.001)。各组细胞迁移率和细胞迁移数量总体比较差异均有统计学意义(F=74.493、1625.431,均P<0.001),其中CLC-2 siRNA转染组细胞迁移率明显低于无义siRNA组,细胞迁移数量明显少于无义siRNA组,差异均有统计学意义(均P<0.01)。各组细胞胶原面积收缩率总体比较差异有统计学意义(F=104.692,P<0.001),其中CLC-2 siRNA转染组细胞胶原面积收缩率明显低于无义siRNA组,差异有统计学意义(P<0.001)。各组CollagenⅠ和CollagenⅢ蛋白相对表达量及p-PI3K/PI3K比值和p-Akt/Akt比值总体比较差异均有统计学意义(F=112.073、456.931、340.889、43.021,均P<0.001),其中CLC-2 siRNA转染组CollagenⅠ和CollagenⅢ蛋白相对表达量及p-PI3K/PI3K比值和p-Akt/Akt比值明显低于无义siRNA组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论靶向抑制CLC-2氯离子通道基因表达可通过PI3K/Akt信号通路促进HConF凋亡,抑制细胞迁移、胶原合成及胶原收缩,抑制纤维化过程。