酵母双杂交技术筛选人白细胞cDNA文库中HCV NS4A结合蛋白及CAML基因的克隆

摘要

目的应用酵母双杂交技术筛选人白细胞中与丙型肝炎病毒非结构蛋白4A（HCV NS4A）相互作用的蛋白。方法连接有HCV NS4A酵母表达的载体pGBKT7-NS4A,转化入单倍体酵母细胞AH109,与转化了人白细胞cDNA文库质粒的单倍体酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-a-半乳糖（X-a-Gal）上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提取质粒,转化入大肠埃希细菌（DH5α）,提取质粒并测序,进行生物信息学分析。对克隆重复率较高的蛋白编码基因进行克隆和回交验证。结果筛选出在四缺（SD/-Trp-Leu-Ade-His）培养基和在铺有X-a-gal的四缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落45个,其中钙离子信号调节亲环素配体（CAML）29个。对CAML基因成功克隆,回交验证了HCV NS4A与CAML的相互作用。结论成功筛选出7种在人白细胞cDNA文库中与HCV NS4A特异性相互作用的蛋白,为进一步探讨HCV的致病机制提供了新的线索。