L-亚氨基乙基鸟氨酸与过量氟共培养对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞一氧化氮/内皮型一氧化氮合酶表达的影响

摘要

目的探讨内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase,eNOS）特异性抑制剂L-亚氨基乙基鸟氨酸（L-iminoethyl ornithine hydrochloride,L-NIO）对氟致体外培养人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡、eNOS mRNA和蛋白表达以及一氧化氮（Nitric oxide,NO）含量和一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,NOS）活性改变的影响。方法将体外培养的SH-SY5Y细胞分为对照组、低氟组、高氟组、L-NIO组、低氟+L-NIO组、高氟+L-NIO组,n=3。对照组加入与实验组等体积的培养液,低氟组和高氟组加入氟化钠（sodium fluoride,NaF）浓度分别为0.2、2.0 mmol/L,L-NIO组加入3μmol/L L-NIO,低氟+L-NIO组和高氟+L-NIO组分别加入0.2 mmol/L NaF和3μmol/L L-NIO、2.0 mmol/L NaF和3μmol/L L-NIO,培养时间为48 h。采用蛋白免疫印迹（Western blot）法检测细胞中eNOS蛋白表达水平,实时荧光定量PCR（Real-time fluorescent quantitative PCR）法检测细胞中eNOS mRNA表达水平,流式细胞仪检测细胞的凋亡情况,硝酸还原酶法和比色法检测细胞培养液中NO含量和NOS活性。结果与对照组（1.000±0.026）比较,低、高氟组eNOS蛋白表达量（1.108±0.071、1.349±0.057）升高,L-NIO组（0.755±0.148）下降（P均＜0.05）;与低氟组比较,高氟组升高,低氟+L-NIO组（0.802±0.115）下降（P均＜0.05）;与高氟组比较,高氟+L-NIO组（0.988±0.135）下降（P＜0.05）。与对照组（1.000±0.018）比较,低、高氟组eNOS mRNA表达量（1.809±0.099、2.416±0.295）升高,LNIO组（0.609±0.077）下降（P均＜0.05）;与低氟组比较,高氟组升高,低氟+L-NIO组（1.040±0.034）下降（P均＜0.05）;与高氟组比较,高氟+L-NIO组（1.233±0.152）下降（P＜0.05）。与对照组[（1.66±0.07）%]比较,低、高氟组细胞凋亡率[（8.81±0.27）%、（17.60±0.20）%]升高,L-NIO组[（1.03±0.04）%]下降（P均＜0.05）;与低氟组比较,高氟组升高,低氟+L-NIO组[（6.03±0.10）%]下降（P均＜0.05）;与高氟组比较,高氟+L-NIO组[（12.12±0.08）%]下降（P＜0.05）。与对照组[（2.773±0.145）μmol/L]比较,低、高氟组细胞培养液中NO含量[（8.251±1.047）、（14.287±1.062）μmol/L]升高,L-NIO组[（1.648±0.155）μmol/L]下降（P均＜0.05）;与低氟组比较,高氟组升高,低氟+L-NIO组[（4.622±0.252）μmol/L]下降（P均＜0.05）;与高氟组比较,高氟+L-NIO组[（7.899±0.385）μmol/L]下降（P＜0.05）。与对照组[（0.507±0.041）U/ml]比较,低、高氟组细胞培养液中NOS活性[（0.772±0.032）、（2.258±0.062）U/ml]升高,L-NIO组[（0.346±0.015）U/ml]下降（P均＜0.05）;与低氟组比较,高氟组升高,低氟+L-NIO组[（0.637±0.026）U/ml]下降（P均＜0.05）;与高氟组比较,高氟+L-NIO组[（1.161±0.071）U/ml]下降（P＜0.05）。结论过量氟可导致SH-SY5Y细胞eNOS蛋白和mRNA过度表达以及细胞凋亡率上升,细胞培养液中NO含量增多以及NOS活性增强,加入L-NIO与氟共培养后可拮抗氟对SH-SY5Y细胞的损伤,起到一定的神经保护作用。