构建细菌内同源重组型hTERT调控区反义RNA腺病毒载体

摘要

目的:构建细菌内同源重组型端粒酶催化亚单位调控区c-myc结合位点的反义RNA腺病毒重组体.方法:PCR扩增hTERT启动子调控区c-myc结合位点370bp的DNA片段,与腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV连接,以抗生素平板筛选连接阳性的克隆,PCR鉴定方向,构建反向插入的hTERT-c-myc反义RNA腺病毒穿梭载体pShuttle-ashmyc,将PmeⅠ线性化的pShuttle-ashmyc与包装质粒pAdEasy-1共转染受体菌BJ5183进行同源重组.用含有卡那霉素的LB平板筛选同源重组阳性的克隆,酶切鉴定后,以Pac Ⅰ酶切线性化,转染包装细胞293,以软琼脂平板上的空斑数量计算重组腺病毒的滴度.结果:成功构建了端粒酶催化亚单位调控区c-myc结合位点的反义RNA重组腺病毒-pAd-ashmyc,滴度为1.2×109efu/ml.结论:hTERT调控区c-myc 结合位点的反义腺病毒载体的成功构建,为肿瘤的基因治疗奠定了良好的基础.