细胞穿透肽PEP-1介导人铜,锌-超氧化物歧化酶转导入大鼠离体心脏及其对缺血再灌注损伤的保护作用

摘要

目的采用离体心脏灌注模型,研究细胞穿透肽 PEP-1介导人铜,锌-超氧化物歧化酶（Cu,Zn-SOD,SOD1）穿透心肌组织能力及其对心脏缺血再灌注损伤的保护作用。方法构建的原核表达载体 pET15b-SOD1和 pETl5b-PEP-1-SOD1,分别转化大肠杆菌,表达和纯化 SOD1和 PEP-1-SOD1融合蛋白。采用 Langendorff 灌流系统,大鼠离体心脏停灌30 min 后复灌60 min 建立缺血再灌注损伤模型。大鼠随机分为对照组,100μmol/L SOD1蛋白预处理组,25、50、100 μmol/L PEP-1-SOD1蛋白预处理组。免疫荧光及 Western blot 检测 PEP-1-SOD1的转导效果,超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒检测转导的目的蛋白的 SOD 活性。测定心肌组织丙二醛（MDA）含量和复灌后15 min 内冠状动脉流出液肌酸激酶（CK）活性。脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）检测心肌细胞凋亡,复灌60 min 时红四氮唑（TTC）染色测定心肌梗死面积。结果免疫荧光及 Western blot 检测均显示 PEP-1-SOD1以剂量依赖性方式转导入离体灌注的心肌组织内,SOD1蛋白预处理组心肌组织内未见到目的蛋白。对照组,SOD1组和25、50、100 μmol/L PEP-1-SOD1处理组的 SOD 活性分别为（10.06±0.77）,（10.59±0.71）和（32.29±1.42）、（43.16±1.16）、（55.14±1.59）U/mg 蛋白,MDA含量分别为（1.48±0.19）,（1.39±0.11）和（1.01±0.14）、（0.73±0.13）、（0.50±0.06）nmol/mg 蛋白,CK 活性分别为（1.73±0.58）,（1.68±0.14）和（1.40±0.28）、（0.97±0.39）、（0.61±0.56）U/mg 蛋白,心肌细胞凋亡率（AI）分别为（17.25±0.75）%,（16.63±1.07）%和（11.50±0.57）%、（6.50±0.63）%、（4.13±0.52）%,心肌梗死面积百分比分别为（55.13±2.18）%,（52.13±2.59）%和（33.88±2.06）%、（25.50±2.16）%、（15.38±1.14）%。与对照组和 SOD1组比较,PEP-1-SOD13种剂量组的 SOD 活性、MDA 含量、CK 活性、心肌细胞凋亡率及心肌梗死面积百分比指标差异均有统计学意义（均 P＜0.01）。说明 PEP-1-SOD1蛋白预处理组 SOD 活性以剂量依赖性方式显著高于SOD1组,MDA 含量、CK 活性及心肌细胞凋亡率均明显低于 SOD1组,心肌梗死面积小于 SOD1组。结论 PEP-1肽介导 SOD1蛋白能直接以天然活性的形式高效穿透进入离体心肌组织,转导的 PEP-1-SOD1融合蛋白对心肌缺血再灌注损伤具有明显的保护作用。