藏羊HSP27基因过表达和沉默载体构建及对卵泡发育的功能初步分析

摘要

为了深入探究HSP27基因在藏羊卵泡发育过程中的作用,本研究选择健康的(3～4岁)经产藏母羊6只,屠宰获得卵巢组织进行藏羊HSP27基因克隆,利用生物信息学方法分析HSP27基因CDS区序列,构建HSP27基因过表达及沉默载体,分离培养藏羊卵巢颗粒细胞,将构建的载体按不同分组进行细胞转染试验即空白组、过表达载体组、沉默载体组、阴性对照组,每组设3个复孔.显微镜观察各转染组培养0、24、48、72 h的细胞形态变化及细胞计数,RT-PCR检测各转染组HSP27、GDF9、BMPR-1B、Erβ基因mRNA表达量.结果 ,试验成功克隆藏羊HSP27基因,其CDS序列长度为618 bp,编码203个氨基酸.试验成功构建藏羊HSP27基因过表达及沉默载体;将构建的载体转染至卵巢颗粒细胞,随着培养时间的递增各转染组间细胞形态发生改变,过表达载体组细胞由长梭状逐渐变为不规则多边形,细胞核变形分解,沉默载体组细胞周边伪足伸出减少,细胞皱缩大量凋亡;细胞计数结果显示,转染后培养72 h时,沉默载体组细胞数量极显著低于其他3组(P＜0.01),过表达载体组细胞数量显著低于空白组和阴性对照组(P＜0.05).RT-PCR结果显示,过表达载体组细胞HSP27基因mRNA表达量极显著高于空白组(P＜0.01),沉默载体组细胞HSP27基因mRNA表达量极显著低于阴性对照组(P＜0.01),过表达载体组细胞的GDF9、BMPR-1B、Erβ基因mRNA表达量均极显著高于空白组(P＜0.01),沉默载体组细胞EO基因mRNA表达量极显著低于阴性对照组(P＜0.01).由此可初步推测,当HSP27基因过表达时能够促进颗粒细胞增殖分化,当沉默HSP27基因时可能会触发颗粒细胞凋亡进而影响卵泡发育,以上研究成果可为HSP27基因在藏羊卵泡发育过程中的功能研究奠定试验基础.