鼠伤寒沙门菌伴侣蛋白Hfq与小RNA GcvB结合位点的初步分析

摘要

旨在探究Hfq与GcvB可能的作用结合位点,本研究首先筛查GcvB中Hfq结合偏好型富U基序。通过λ-Red同源重组酶系统构建GcvB富U基序突变或截短菌株,构建GcvB终止子茎延伸菌株。运用P22噬菌体转导技术构建相应的hfq基因缺失菌株以及oppA::lacZ基因融合菌株。通过qRT-PCR检测重组菌株的gcvB基因转录水平,β-半乳糖苷酶试验检测oppA基因编码蛋白水平。预测结果显示,GcvB存在2个Hfq结合偏好型富U基序U_(5)和U_(8)。qRT-PCR结果显示,U_(5)基序的突变未造成gcvB基因转录水平明显的变化,而gcvB基因转录水平随U_(8)基序的截短而下调,截短为U_(5)和U_(4)时下调最为明显,分别下调40.5%和37.5%。延伸U_(4)截短菌株的GcvB终止子茎,结果发现,gcvB基因转录水平几乎恢复到了对照组的水平,同时也发现,尽管U_(4)截短菌株gcvB基因转录水平得以恢复,却丧失了Hfq协同GcvB转录后负调控oppA mRNA的能力。以上结果表明,U_(5)基序与Hfq维持GcvB稳定性无明显关联。U_(8)基序对Hfq协助GcvB转录后负调控oppA mRNA以及维持GcvB稳定性是重要的,推测其为Hfq与GcvB的作用结合位点。