黄连素剂量依赖性抑制脂多糖刺激下大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞促凝和纤溶抑制因子的表达

摘要

目的 探讨黄连素对脂多糖(LPS)刺激下大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(AECⅡ)表达及分泌促凝和纤溶抑制相关因子的影响.方法 体外培养大鼠AECⅡ细胞株RLE-6TN,取对数生长期细胞,用细胞增殖与毒性检测试剂盒(CCK-8)检测黄连素对细胞的毒性作用,根据半数抑制浓度(IC50)确定药物浓度范围.将对数生长期细胞分为5组:空白对照组使用DMEM培养基常规培养;LPS组在培养基中加入5 mg/L的LPS刺激细胞;黄连素预处理组先分别加入20、50、80 μmol/L黄连素预处理1 h后,再加入5 mg/L的LPS共培养.LPS刺激24 h 后收集细胞,采用蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)及实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测细胞组织因子(TF)、组织因子途径抑制物(TFPI)、纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)的蛋白和mRNA表达;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清液中活化蛋白C(APC)、Ⅲ型前胶原肽(PⅢP)、凝血酶-抗凝血酶复合物(TAT)及抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)的含量.结果 根据抑制率曲线计算得出黄连素对RLE-6TN细胞的IC50为81.16 μmol/L,故选择20、50、80 μmol/L作为黄连素的干预浓度.与空白对照组相比,LPS刺激24 h后RLE-6TN 细胞表达及分泌促凝和纤溶抑制相关因子异常,表现为TF、PAI-1的蛋白及mRNA表达水平均明显升高,TFPI的蛋白及mRNA表达水平明显降低;同时细胞上清液中APC、ATⅢ含量均明显降低,而PⅢP、TAT含量均明显升高.给予黄连素预处理后,LPS刺激诱导的RLE-6TN细胞表达及分泌促凝和纤溶抑制相关因子异常情况得到纠正,并呈现一定的剂量依赖性,以80 μmol/L时作用更为显著;与LPS组相比,黄连素80 μmol/L预处理组细胞中TF、PAI-1的蛋白及mRNA表达水平均明显降低〔TF蛋白(TF/GAPDH):0.45±0.02比0.55±0.03,TF mRNA(2-ΔΔCt):0.39±0.08比1.48±0.11,PAI-1蛋白(PAI-1/GAPDH):0.37±0.02比0.64±0.04,PAI-1 mRNA (2-ΔΔCt):1.14±0.29比4.18±0.44,均P<0.01〕,TFPI蛋白及mRNA表达水平明显升高〔TFPI蛋白(TFPI/GAPDH):0.53±0.02比0.45±0.02,TFPI mRNA(2-ΔΔCt):0.94±0.08比0.40±0.05,均P<0.01〕;同时细胞上清液中APC、 ATⅢ含量明显升高〔APC(μg/L):1 358.5±26.0比994.2±23.1,ATⅢ(μg/L):118.0±7.4比84.4±2.7,均P<0.01〕,而PⅢP和TAT含量则均明显降低 〔PⅢP(μg/L):11.2±0.4比18.6±0.9,TAT(ng/L):222.1±2.8比287.6±7.0, 均P<0.01〕.结论 黄连素可以剂量依赖性抑制LPS刺激下大鼠AECⅡ细胞促凝及纤溶抑制相关因子表达和分泌,促进抗凝因子表达和分泌,有望成为有效防治急性呼吸窘迫综合征(ARDS)肺泡过度促凝和纤溶抑制的新靶点.