缺氧/再复氧与脂多糖激活肠上皮细胞核转录因子-κB和低氧诱导因子-1α信号通路以及大黄素对其的干预作用

摘要

目的以缺氧/再复氧（H/R）和脂多糖（LPS）刺激人结肠上皮细胞株（FHC）模拟体内肠上皮细胞遭受缺血、缺血/再灌注和炎症打击的病理过程,探讨大黄素干预的可能作用靶点。方法常氧组:在37℃下用95%空气和5%CO2培养。缺氧（H）组:于37℃下用1%O2、5%CO2和94%N2的混合厌氧气体使细胞缺氧1、2、3、4 h。H+LPS组:在H组基础上给予LPS1mg/L刺激。H/R组:于缺氧3h后分别复氧1、2、3、4 h。H/R+LPS组:在H/R基础上给予LPS 1 mg/L刺激。大黄素干预组:在H3 h/R2 h+LPS基础上给予20、40、60、80μmol/L大黄素进行干预。用蛋白质免疫印迹试验（Western Blot）检测磷酸化核转录因子-κB（NF-κB）抑制蛋白-α（pIκB-α）、磷酸化NF-κBp65（pNF-κBp65）、环氧化酶-2（COX-2）、低氧诱导因子-1α（HIF-1α）蛋白表达。相差显微镜下观察各组肠上皮细胞的形态学改变;用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测大黄素对肠上皮细胞增殖情况的影响。结果①H组:pIκB-α、pNF-κBp65、COX-2表达量均于H1h达峰值,分别为0.350±0.018、1.083±0.054、0.903±0.045,然后递减（F值分别为3.011、7.247、5.754,P值分别为0.013、0.000、0.005）;HIF-1α在H3h表达最高（1.511±0.076）,但各时间点间比较无差异（F=1.881,P=0.062）。H+LPS组:pIκB-α、pNF-κBp65、COX-2、HIF-1α表达量均随缺氧时间延长而增加,H3 h达峰值,分别为0.504±0.025、1.255±0.063、0.812±0.041、1.209±0.075（F值分别为2.683、8.774、9.765、2.432,P值分别为0.011、0.000、0.000、0.026）。H/R组:随着再复氧时间延长,pIκB-α、pNF-κBp65、COX-2表达递减,于H3h/R4h降至最低,分别为0.712±0.034、1.202±0.048、0.691±0.042（F值分别为1.923、6.765、2.719,P值分别为0.063、0.000、0.016）;与H组相比,H/R组HIF-1α在再复氧过程中表达明显减少,但各时间点间无差异（F=1.280,P=0.081）。H/R+LPS组:随着再复氧时间延长,pIκB-α、pNF-κBp65、COX-2、HIF-1α并无降解,于R2~3h达峰值,分别为3.302±0.061、2.315±0.055、2.017±0.043、2.413±0.098（F值分别为4.614、1.652、5.970、2.076,P值分别为0.001、0.067、0.000、0.037）。大黄素共同干预组:大黄素可以抑制NF-κB和HIF-1a通路蛋白表达,存在量效关系（P＜0.05或P＜0.01）。80μmol/L大黄素可使pIκB-α、pNF-κBp65、COX-2、HIF-1α蛋白表达量降至最低,分别为2.599±0.130、1.772±0.089、2.590±0.129、2.518±0.125;大黄素后处理细胞则无此效果。②经过H/R+LPS处理的细胞内发生空泡样变、形态改变、细胞融合,相比H组生长速度缓慢。③MTT法检测结果显示,20~80μmol/L大黄素对细胞增殖无明显影响,说明大黄素在此浓度范围不仅产生了生物学效应,且对细胞无药物毒性。结论缺氧或炎症均可激活HIF-1α的缺氧通路和NF-κB的炎症通路,在H/R过程中,这两条通路蛋白随着再复氧时间延长表达降低,但在H/R+LPS过程中蛋白仍相对高表达,缺血/再灌注损伤可能与内毒素共同作用破坏肠上皮细胞,导致肠源性脓毒症的发生。在炎症早期阶段而非晚期阶段,用大黄素可以阻断NF-κB/HIF-1α-COX-2信号通路,从而发挥抗炎作用。