海滨雀稗以hpt与bar基因为筛选标记的转化体系比较研究

摘要

海滨雀稗作为耐盐性较强的暖季型草坪草,具有极大的应用潜力。为建立高效稳定的海滨雀稗遗传转化体系,本研究以海滨雀稗成熟种子为外植体,确定了筛选剂潮霉素和草丁膦在海滨雀稗的愈伤组织继代培养和再生阶段的最佳筛选压。在进一步优化遗传转化条件的基础上,比较了以hpt与bar基因作为转基因筛选标记对海滨雀稗农杆菌介导的遗传转化效率的影响。结果表明:愈伤组织的再生率在继代36周后显著下降,继代48周的最高再生率为67.9%。潮霉素的最佳筛选压在继代培养阶段为120 mg·L^(-1),再生阶段为80 mg·L^(-1)。草丁膦的最佳筛选压均为1.2 mg·L^(-1)。选取继代24周的愈伤组织用于农杆菌介导的遗传转化,最佳的转化条件为菌液浓度OD600=0.6,添加100μmol·L^(-1)乙酰丁香酮和0.01%的Silwet L-77,并辅以超声波处理20 min或真空处理10 min,浸染30min后共培养2 d。通过多次抗性愈伤组织和抗性再生苗的筛选,2种载体均获得了转基因再生植株。通过PCR检测证明hpt和bar基因分别成功在海滨雀稗基因组中表达。以潮霉素作为筛选剂,β-葡萄糖醛酸糖苷酶(GUS)基因稳定表达及PCR检测的转基因的平均效率为18.9%,最高转化效率为20.3%,均高于以草丁膦为筛选剂的转化效率。由此可见,hpt基因更适合作为海滨雀稗遗传转化中的筛选标记,能够获得更高的转基因效率。