褐飞虱中肠两种氨肽酶N的鉴定及蛋白特性分析

摘要

[目的]氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)是昆虫消化系统中重要的蛋白酶.本研究旨在对在褐飞虱Nilaparvata lugens中肠中两个具有较高转录水平的apn基因(nlapn1和nlapn4)在中肠上皮细胞上的表达及其蛋白功能特性进行鉴定与分析.[方法]利用最大似然法进行褐飞虱NLAPN1和NLAPN4的系统进化分析;利用Western blot分析NLAPN1及NLAPN4在中肠刷状缘膜囊泡(brush border membrane vesicles,BBMVs)中的定位;利用LC-ESI-MS/MS技术对Western blot定位的NLAPN1及NLAPN4进行鉴定.在果蝇Drosophila S2细胞内分别表达两个NLAPN蛋白,并利用Western blot及免疫荧光定位技术对NLAPN1与NLAPN4进行S2细胞内的定位;分别以L-亮氨酸对硝基苯胺(leucine-p-NA)、L-丙氨酸4-硝基苯胺盐酸盐(Ala-p-NA)、L-甲硫氨酸对硝基苯胺盐酸盐(Met-p-NA)和L-赖氨酸对硝基苯胺二氢溴酸盐(Lys-p-NA)为底物测定NLAPN1和NLAPN4的酶活性.[结果]系统进化树分析结果显示,褐飞虱NLAPN1及NLAPN4与其他半翅目昆虫肠道中高表达的APN分在了同一分支中.Western blot及LC-ESI-MS/MS质谱分析结果证明NLAPN1与NLAPN4均存在于褐飞虱中肠刷状缘膜囊泡中,分子量约为160 kD.Western blot及免疫荧光定位结果显示,两个NLAPN蛋白均位于S2细胞膜上,而C端缺失糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol,GPI)锚定位点的NLAPN41ackG蛋白分布在细胞质中.酶活性测定结果显示,以L-丙氨酸4-硝基苯胺盐酸盐及L-赖氨酸对硝基苯胺二氢溴酸盐为底物时NLAPN1和NLAPN4都具有一定的酶活性,而以L-亮氨酸对硝基苯胺为底物时NLAPN1有极高的酶活性(＞ 60 U/mg).[结论]NLAPN1与NLAPN4是褐飞虱中肠上皮细胞膜上高表达的两个膜结合APN蛋白,且都通过C端的GPI锚定附着在细胞膜上.NLAPN1与NLAPN4与鳞翅目、鞘翅目、双翅目等昆虫中肠膜结合APN有着近似的蛋白结构与酶学特性.膜结合APN在褐飞虱中肠中的生理生化功能及其与外源病原物的互作机制还有待进一步深入研究.