血清1α,25-二羟维生素D液相色谱串联质谱检测方法的建立及其应用

摘要

目的:建立一种同位素稀释高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)方法测定血清1α，25-二羟维生素D2(1α，25(OH)2D2)和1α，25-二羟维生素D3(1α,25(OH)2D3);对基于不同方法学的1α，25-二羟维生素D(1α，25(OH)2D)检测系统进行方法学评价及比较;应用本研究建立的LC-MS/MS方法测定表观健康人群血清1α,25(OH)2D水平，尝试建立生物参考区间。
　　方法:采集分离血清样本，以同位素标记的1α，25(OH)2D3作为内标，正己烷-乙酸乙酯溶液作为提取剂，高速涡旋提取。离心后吸取上清，37℃真空离心干燥。残渣用甲醇-水溶液重构后应用LC-MS/MS分析技术进行分析检测。采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，以标准品制作标准曲线结合稳定同位素内标法定量，建立LC-MS/MS法测定1α，25(OH)2D2和1α，25(OH)2D3的方法。对添加不同水平1α，25(OH)2D2和1α，25(OH)2D3标准品的混合人血清连续五天进行重复检测，每次检测每个水平样本进行3次重复测定，以考察方法的精密度。同时评价血清样本添加不同浓度标准品的加样回收率。
　　收集2015年4月至6月期间北京协和医院173例患者血清，同时应用本研究建立的LC-MS/MS方法和Diasorin化学发光免疫测定法(CLIA)检测血清1αα，25(OH)2D3浓度水平并对Diasorin试剂盒检测线性、精密度等性能进行评估。应用Excel2007对检测精密度等数据及血清样本检测结果进行统计分析，比较两种方法的检测性能及临床样本检测结果。
　　收集2015年7月至2015年9月期间北京协和医院体检中心200例表观健康人血清，其中男性与女性各100人，年龄18～87岁。200例表观健康人群中，有175例年龄小于65岁，从175例血清样本中随机抽取20例血清用于参考区间验证，剩余155例血清用于参考区间建立。用本研究建立的LC-MS/MS法测定血清1α，25(OH)2D3和1α，25(OH)2D2浓度。以非参数方法估计样本的参考区间，取2.5％～97.5％百分位数的值作为参考范围，并采用小样本验证的方法对参考区间进行验证。
　　结果:用LC-MS/MS法在本实验条件下可同时检测血清1α，25(OH)2D2和1α，25(OH)2D3，化合物保留时间约为4.7 min，分析时间为10 min，特异性高，未见明显干扰因素。化合物与内标峰面积比与对应的浓度线性相关系数均大于0.990。1α,25(OH)2D2批内和总变异分别为:3.88％～6.35％和5.43％～9.41％，1α，25(OH)2D3批内和总变异分别为2.34％～6.79％和5.37％～8.40％。1α，25(OH)2D2和1α，25(OH)2D3的加祥回收率范围分别为:95.80％～104.21％和95.91％～99.83％。1α，25(OH)2D2和1α，25(OH)2D3的检测限(LOD)均为5pg/mL，定量限(LOQ)均为10 pg/mL，具有较高的灵敏度。
　　Diasorin CLIA法测定血清1α，25(OH)2D3浓度的批内变异分别为2.7％、5.0％和5.0％，总变异分别为13.8％、15.0％和13.5％。取高值(167.8 pg/mL)和低值(36.4pg/mL)两种血清按不同比例混合稀释，并用Diasorin试剂盒重复测量检测，评价Diasorin CLIA法检测试剂盒的检测线性，得到的线性方程为:y=0.916x+3.626(R2=0.991)。173例血清样本两种方法检测结果的相关分析方程为:y=0.9614x+4.3977，R2=0.8041。将两种方法测定173例患者血清样本结果作Bland-Altman图，差值范围为-23.1 pg/mL～26.1 pg/mL，5.78％(10/173)的样本检测结果落在95％一致性界限以外。LC-MS/MS法获得人群的95％参考区间为32.9 pg/mL～112.5 pg/mL。
　　结论:本研究成功建立了同时测定血清1α，25(OH)2D2和1α，25(OH)2D3的LC-MS/MS方法，该方法无需对待测物进行衍生化处理，操作简便、灵敏度好、特异性高，可应用于评价血清1α，25-二羟维生素D的含量。应用此方法评价的CLIA方法性能较好，可用于临床。应用本研究建立的LC-MS/MS方法初步建立的参考区间。

目录

中英文缩略词表

摘要

引言

试剂、仪器和材料

1．化学试剂

2．血清样品

3．仪器设备

实验方法和结果

1．标准溶液和内标液的配制

2．质控品制备

3．样品制备条件的选择与优化

3．1 提取方式的确定和优化

3．2 提取剂的选择和优化

4．质谱条件的选择与优化

4．1 离子源、检测模式的选择

4．2 母离子和子离子的选择

5．液相色谱条件的选择与优化

6．标准曲线

7．干扰试验

7．1 (24R)-24，25(OH)2D3、(24S)-24，25(OH)2D3和(23R)-23，25(OH)2D3标准品的配制

7．2 (24R)-24，25(OH)2D3、(24S)-24，25(OH)2D3和(23R)-23，25(OH)2D3的质谱检测

7．3 (24R)-24，25(OH)2D3、(24S)-24，25(OH)2D3和(23R)-23，25(OH)2D3的LC-MS／MS检测

7．4 干扰检测结果及结论

8．基质效应评估

8．1 样品制各

8．2 LC-MS／MS检测及结果

9．线性、检测限与定量限

9．1 线性

9．2 检测限与定量限

10．精密度测定

11．液相色谱串联质谱方法对常规检查试剂盒配套质控品的检测

12．加样回收率

13．稳定性研究

13．1 冻融稳定性

13．2 提取后样本稳定性

13．3 长期稳定性

13．4 新鲜血样本中待测化合物稳定性

13．5 稳定性结论

14．LC-MS／MS方法初步应用

15．小结

方法应用

1．CLIA方法的评价及其与LC-MS／MS法和RIA法的检测结果比较

1．1 CLIA方法评价

1．2 LC-MS／MS法与CLIA法测定结果的关系

1．3 RIA检测结果与LC-MS／MS和CLIA结果的比较

2 表观健康人群参考区间研究

讨论

结论

参考文献

文献综述 维生素D检测研究进展

致谢

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