骨髓间充质干细胞移植治疗帕金森病的基础研究

摘要

目的：评估骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植治疗帕金森病的效果，探讨其作用机制，并比较两种移植途径对疗效的影响，为干细胞移植治疗帕金森病提供理论基础。探讨活体成像监测荧光细胞变化趋势的条件。
　　 方法：建立帕金森病(PD)大鼠模型，随机分为三组：颅内注射组——应用立体定位技术将BMSCs移植到PD大鼠的纹状体内；静脉注射组——经尾静脉输注BMSCs悬液；空白对照组——纹状体内(注射点同颅内注射组)注入生理盐水。利用BMSCs贴壁生长的特性筛选、扩增大鼠骨髓间充质干细胞。应用携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的病毒载体转染BMSCs。
　　 应用UVP活体成像系统，测定GFP标记BMSCs荧光成像的灰度值，建立BMSCs细胞数量与成像面积密度的拟合曲线。对行GFP标记BMSCs移植治疗的PD大鼠成像，应用拟合曲线计算大鼠脑组织内2周、4周及8周时BMSCs的存活情况。
　　 从不同层面分析移植BMSCs对PD大鼠的作用，探讨BMSCs的作用机制：(1)检测PD大鼠移植BMSCs后2周、4周及8周阿朴吗啡(APO)诱导的旋转行为变化，评估BMSCs的治疗效果及组间差异。(2)高效液相色谱-电化学法(HPLC-ECD)检测BMSCs移植前后不同组别PD大鼠脑内多巴胺(DA)及其代谢产物二羟苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)含量，判定DA分泌功能状况，分析疗效。(3)病理检测移植后的BMSCs细胞形态及周围组织变化；荧光免疫组织化学法证实移植BMSCs的分化方向。
　　 结果：GFP标记大鼠BMSCs可以稳定传代，冻存、复苏后仍保持GFP表达。UVP成像技术测得的成像面积密度与荧光细胞数量呈良好的线性关系。BMSCs移植后PD大鼠经UVP成像，应用拟合曲线半定量测定大鼠脑组织内存活GFP-BMSCs的数量，可见其随移植时间的延长而逐渐降低。
　　 BMSCs移植后第2、4及8周，以APO诱导PD大鼠出现旋转行为，发现颅内注射组、静脉注射组PD大鼠旋转次数均较空白对照组显著减少(p<0.05)；颅内注射组较静脉注射组显著减少(p<0.05)；颅内注射组及静脉注射组均较BMSCs移植前显著减少(p<0.05)。
　　 BMSCs移植后4周HPLC检测结果显示，颅内注射组、静脉注射组DA及其代谢产物DOPAC、HVA含量均高于空白对照组(p<0.05)；颅内注射组DA、DOPAC、HVA含量高于静脉注射组(p<0.05)。
　　 大鼠脑组织切片显示，颅内注射组和静脉注射组脑组织形态结构较空白对照组无明显变化，未见炎细胞浸润和毛细血管充血等现象，未见移植BMSCs过度增殖。BMSCs注射后2、4与8周，颅内注射组、静脉注射组大鼠脑组织内均可见GFP标记细胞，颅内注射组毁损区对侧脑内可见少量GFP标记细胞。免疫组化显示，BMSCs注射后4周、8周，颅内注射组和静脉注射组大鼠脑组织内多巴胺能神经元细胞标志物TH-1的表达显著高于空白对照组，以颅内注射组TH-1表达增多更为显著，可见GFP/TH-1双阳性细胞；颅内注射组和静脉注射组大鼠脑组织内星形胶质细胞标志物GFAP的表达显著高于空白对照组，颅内注射组和静脉注射组无显著差异，可见GFP/GFAP双阳性细胞；颅内注射组和静脉注射组大鼠脑组织内NSE的表达显著高于空白对照组，以颅内注射组NSE表达增多更为显著，可见GFP/NSE双阳性细胞。
　　 结论：(1) BMSCs移植治疗PD大鼠有效、安全。BMSCs移植后帕金森病大鼠的行为学障碍出现改善，移植后的BMSCs可在脑组织内长期存活，无致炎性，无过度增殖。(2) BMSCs移植治疗PD的可能作用机制：移植BMSCs分化成多巴胺能神经元而起替代作用；移植BMSCs分化为星形胶质细胞而释放神经营养因子，修复损伤；移植BMSCs提供了一个有利于病变组织修复的微环境。(3)颅内定点移植与静脉移植都能够产生积极的治疗作用，但前者效果优于后者。(4) UVP活体成像系统能够半定量细胞的数量、追踪其变化趋势。