脑红蛋白在大鼠视网膜生后发育中的表达及亚细胞分布

摘要

视网膜循环障碍性疾病是以缺血及其所致的缺氧为主要病因的眼科临床常见的致盲性疾病之一，因此对视网膜氧代谢，包括氧的运输、分布和消耗的分子机制的探讨是预防和治疗此类疾病的关键。Burmester等于2000年发现的脑红蛋白(Neuroglobin，Ngb)是一种与神经系统氧代谢有着密切关系的呼吸蛋白，有研究发现，视网膜是人体内耗氧率最高的组织，同时视网膜也是体内Ngb表达最高的组织，提示Ngb在视网膜氧代谢中可能发挥着重要的作用。本实验旨在观察生理状态下Ngb在大鼠视网膜中的表达情况，包括发育阶段的表达变化及其亚细胞定位，初步探讨其可能的生理功能，并为研究缺氧条件下Ngb发挥对视网膜神经元的保护作用的机制提供实验基础。
　　 目的：
　　 1、观察大鼠视网膜组织生后发育的情况及在不同发育阶段中Ngb的表达，探讨生理状态下Ngb在视网膜组织发育中的变化规律；
　　 2、观察正常成年大鼠视网膜中Ngb在亚细胞水平的表达，推测其在氧代谢中的参与环节和可能的生理功能。
　　 方法和内容：
　　 实验一：大鼠视网膜生后发育不同阶段Ngb的表达
　　 1、取鼠龄分别为出生后1、3、7、14、28天和成年(2～3月龄)(以下分别用P0. P3、P7、P14、P28、PA表示)的Sprague Dawley(SD)大鼠眼球(每组4只动物)，制成切片，分别应用苏木精-伊红(hemotoxylin-eosin，H-E)染色和免疫荧光化学的方法检测不同时间点视网膜的结构及Ngb的表达定位；
　　 2、同样方法取上述时间点SD大鼠眼球的视网膜组织(每组4只动物)，应用Western Blot(WB)方法检测各个阶段Ngb的表达量；
　　 实验二：电镜免疫金-银细胞化学法观察Ngb在成年大鼠视网膜中的亚细胞
　　 定位。
　　 结果：
　　 1、H-E染色可见大鼠出生后视网膜尚未发育完全。P0:仅见视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)层、成神经细胞层、原始内丛状层(innerplexiform layer，IPL)和节细胞层(ganglion cell layer， GCL)；P3与P0近似；P7: GCL变薄，内、外核层(inner nuclear layer， INL； outer nuclear layer，ONL)分离，外丛状层(outer plexiform layer， OPL)和视锥视杆层的内节段(inner segment，IS)开始出现；P14以后：视网膜呈现典型的10层结构；
　　 2、免疫荧光化学染色可见表达于细胞层的Ngb均位于胞质内。P0:在视网膜GCL和RPE层中有明显的Ngb阳性着染，成神经细胞层内侧细胞也有少许着染；P3与Po相似；P7: Ngb主要表达于GCL、IS，另IPL、INL(尤其是其内侧)、OPL及RPE层也有少许表达；P14: Ngb表达位置同P7，但强弱有所变化，GCL及IS表达最强，IPL、INL和OPL表达次之，RPE较弱；P28及PA表达与P14近似；
　　 3、WB结果显示：在上述各时间点均可检测到Ngb的蛋白条带，各组间表达丰度有显著性差异(p<0.05)，其中以P14组蛋白表达最高；
　　 4、免疫电镜显示：Ngb表达部位在电镜下表现为高电子密度的免疫金颗粒，可见于大鼠的GCL、IPL、INL、OPL、IS和RPE层。在细胞层Ngb定位于细胞的胞质内，线粒体周围多见，内质网和高尔基复合体的管腔外侧也可见Ngb阳性着色；在丛状层Ngb分布于突触前成分的突触小泡之间。
　　 结论：
　　 1、大鼠视网膜在生后14天基本完成结构上的分化；
　　 2、Ngb在大鼠视网膜生后发育的全过程中均有表达，表达的位置和强度与相应时期视网膜的分化程度有一定的对应关系，且与视网膜内线粒体的分布关系较为密切，提示Ngb可能参与了视网膜生后发育过程中的氧代谢；
　　 3、Ngb的表达水平在第14天为最高，进一步提示其与视网膜氧耗之间的密切关系；
　　 4、Ngb特殊的亚细胞分布提示其与神经元供氧的紧密关系。