骨髓间充质干细胞治疗药物性聋的基础研究

摘要

感音神经性聋主要由耳蜗毛细胞或听觉神经病变引起。毛细胞位于耳蜗内，是高度特异性机械感受器，其功能障碍、损伤甚至缺失是耳蜗病变引起感音神经性聋的主要原因。相对于非哺乳动物，哺乳动物毛细胞损伤后不能自发再生，由此引起的听力损失难以恢复。应用干细胞进行细胞替代治疗是毛细胞缺失后恢复听力的一个主要治疗策略。骨髓间充质干细胞易于收集和增殖、能够自体移植、无临床应用伦理问题和免疫障碍，具有多潜能性，是目前进行干细胞替代治疗的主要干细胞来源。体外研究显示骨髓间充质干细胞在一定细胞蛋白作用下具有很强的可塑性，能够分化为神经元细胞类型。但是，骨髓间充质干细胞能否分化为内耳毛细胞或前体细胞，干细胞移植到内耳能否存活和分化，能否替代损伤的听毛细胞，这些都还不清楚。
　　 本课题对大鼠骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化耳蜗毛细胞和骨髓间充质干细胞内耳导入正常和药物性聋耳蜗内的存活和分化情况进行了研究。本研究共分为两部分：
　　 第一部分 骨髓间充质干细胞体外诱导分化为毛细胞样细胞
　　 目的：探讨骨髓间充质干细胞体外定向分化为耳蜗毛细胞的可行性。
　　 方法：1、体外分离培养骨髓间充质干细胞，观察不同换液方式对骨髓间充质干细胞纯化和增殖的影响；RT-PCR检测培养细胞表面分子表达；定向诱导培养细胞向成脂细胞、成骨细胞方向分化。2、采取不同细胞诱导因子定向诱导培养骨髓间充质干细胞地向分化为内耳毛细胞，培养后细胞进行免疫组化鉴定和扫描电镜观察。
　　 结果：1、24小时首次半量换液可使分离细胞在7天内迅速增殖铺满细胞培养皿，培养细胞表面分子SH2、CD31、CD44呈阳性表达，但不表达CD34，培养细胞可分别向脂肪细胞及成骨方向分化。2、体外骨髓间充质干细胞诱导后呈现神经干细胞样形态并表达其特异性标志Nestin，继续诱导分化表达内耳毛细胞特异性标志MyosinⅦa，电镜观察可见细胞表面长出微绒毛，类似毛细胞的静纤毛。
　　 结论：1、24小时首次半量换液培养有利于大鼠骨髓间充质干细胞的分离和纯化，培养细胞证实为骨髓间充质干细胞。2、骨髓间充质干细胞体外可定向诱导分化为内耳毛细胞样细胞。
　　 第二部分 骨髓间充质干细胞内耳移植治疗药物性聋
　　 目的：1.探讨用于干细胞替代治疗研究的感音神经性聋动物模型的建立方法；2.观察骨髓间充质干细胞移植对正常耳蜗的影响；3.研究骨髓间充质干细胞移植到药物性聋耳蜗内的存活和分化情况。
　　 方法：1、应用不同剂量阿米卡星连续1周，通过听觉脑干反应阈值、耳蜗常规切片和扫描电镜观察，确定适合用于骨髓间充质干细胞移植的感音神经性聋大鼠动物模型。2、经鼓阶途径将骨髓间充质干细胞移植到正常听力大鼠耳蜗内，通过听觉脑干反应阈值、耳蜗常规切片观察骨髓间充质干细胞移植对耳蜗结构和功能的影响。3、经鼓阶途径将骨髓间充质干细胞移植到药物性聋大鼠耳蜗内，通过听觉脑干反应阈值、免疫组化和扫描电镜观察植入细胞对感音神经性聋听功能的影响及植入细胞在耳蜗内的分化情况。
　　 结果：1、应用阿米卡星按500mg·kg-1·d-1进行连续一周皮下注射，可造成大鼠听觉永久性阈移，3周后观察柯替器毛细胞缺失，支持细胞损伤，呈现立方上皮样结构。2、骨髓间充质干细胞鼓阶导入对正常大鼠听功能和耳蜗结构无明显影响，可在鼓阶和前庭阶内贴壁或游离存活至少4周。3、骨髓间充质干细胞移植到药物性聋动物耳蜗内可迁移到耳蜗基底膜处并具有听毛细胞特征，移植后8周听功能大多无明显改善。
　　 结论：1、应用阿米卡星可以建立起适合骨髓间充质干细胞替代治疗的理想动物模型。2、骨髓间充质干细胞移植适合进行耳蜗病变的替代治疗。3、骨髓间充质干细胞移植到药物性聋耳蜗内可以存活定位于基底膜外毛细胞区域，表现内耳听毛细胞特征。

目录

文摘

英文文摘

基金项目

中英文缩略词表

引言

参考文献

第一部分 骨髓间充质干细胞体外诱导分化为毛细胞样细胞

第一节 大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及初步鉴定

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

参考文献

第二节 大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为毛细胞样细胞

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

参考文献

第二部分 骨髓间充质干细胞内耳移植治疗药物性聋

第一节 阿米卡星对幼年大鼠内耳的毒性作用

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

参考文献

第二节 骨髓间充质干细胞鼓阶导入内耳后对内耳形态和功能的影响

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

参考文献

第三节 骨髓间充质干细胞移植治疗药物性聋

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

参考文献

结论与展望

文献综述一

参考文献

文献综述二

参考文献

在读期间发表文献

致 谢