烫伤大鼠骨骼肌AMPK的活化对蛋白分解的作用及其信号转导机制

摘要

目的：严重烧伤后骨骼肌蛋白代谢以高分解代谢和负氮平衡为特点，我所以往研究发现泛素蛋白酶体途径是骨骼肌蛋白分解的主要机制，其中肌肉萎缩盒F蛋白（MAFbx）和肌肉特异性环指蛋白1（MuRF1）是骨骼肌蛋白分解的关键酶，胰岛素能够抑制骨骼肌蛋白分解。但目前对于烧伤后骨骼肌MAFbx和MuRF1表达变化及其调节机制的研究尚不完善。
　　 已知泛素蛋白酶体参与的蛋白分解过程需要ATP提供能量，骨骼肌的能量状态可能影响着蛋白分解代谢。单磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMPK）是调节三磷酸腺苷（ATP）生成的关键分子，近年来又发现AMPK的活化抑制蛋白合成，然而，迄今为止对于骨骼肌能量状态及AMPK对骨骼肌蛋白分解代谢影响和机制的报道甚少。为进一步阐明烧伤后骨骼肌蛋白分解代谢的机制，指导临床治疗，本课题试图通过动物实验和细胞培养实验探讨：（1）烫伤大鼠骨骼肌蛋白分解、能荷和AMPK的变化；（2）烫伤大鼠血清对L6肌管蛋白分解、能荷和AMPK的影响：（3）L6肌管AMPK对蛋白分解的调节作用，及其与胰岛素信号通路相互作用的机制。
　　 方法：1.动物实验：雄性Wistar大鼠100只（180～220g），随机分为两组：（1）对照组（n=50）；（2）烫伤组（n=50），背部置于94℃热水12s致30％总体表面积（TBSA）Ⅲ度烫伤。分别于伤后6h、1d、3d、5d和7d（n=10）麻醉处死大鼠，解剖分离双侧胫骨前肌、趾长伸肌（EDL）和比目鱼肌。实验过程中每日称量体重，实验结束时称量肌肉重量。Western blotting检测胫骨前肌AMPK表达和活性，实时定量PCR（Q-PCR）检测胫骨前肌AMPKα、丝氨酸/苏氨酸激酶11（LKB1）、MAFbx及MuR目的mRNA表达水平，高效液相色谱法（HPLC）测定胫骨前肌核苷酸水平，计算AMP（单磷酸腺苷）/ATP比值和细胞能荷（EC）。
　　 2.细胞培养实验A：采用上述烫伤动物模型，雄性Wistar大鼠40只（200～250g），随机分为两组：对照组（n=20）和烫伤组（n=20），伤后12h无菌抽取大鼠腹主动脉血液，制备血清。10％胎牛血清（FBS）预处理低血清分化的L6肌管12h后，分别采用含10％假伤大鼠血清的DMEM（10％SS组）、或含10％烫伤大鼠血清的DMEM（10％BS组）孵育肌管不同时间（0、10min、1h、6h、24h）。L6肌管蛋白、mRNA和核苷酸水平的测定同方法1。
　　 3.细胞培养实验B：低血清分化的L6肌管于无血清DMEM中预处理12h后，分别于不同浓度或不同时间条件下，用含AMPK活化剂（AICAR，5-咪唑-4-酰胺-1-β-D-呋喃糖核苷）或含胰岛素的DMEM处理L6肌管，部分实验中采用P13K抑制剂（wortmannin）、Akt抑制剂（Akt Inhibitor IV）或AMPK抑制剂（Compound C）预处理肌管1h。Western blotting检测L6肌管AMPK、Akt、糖原合成酶激酶（GSK）3-β和乙酰辅酶A羧化酶（ACC）的表达及其活性，mRNA和核苷酸水平的检测同方法1。
　　 结果：1.（1）大鼠烫伤后体重较对照组下降，于伤后3d最为显著（p<0.05）。大鼠EDL重量和EDL重量/体重比值于伤后1～3d显著低于对照组（p<0.01）。（2）与对照组比较，烫伤后6h胫骨前肌MAFbx mRNA表达明显上调（p<0.01），烫伤后6h和1d，胫骨前肌MuRF1 mRNA表达明显上调（p<0.01），于5d和7d明显下降（p<0.01或p<0.05）。（3）烫伤后6h，大鼠胫骨前肌AMPKα（Thr172）磷酸化水平高于对照组（p<0.05），其后逐渐下降，于3d显著低于对照组（p<0.01），以后又升高。烫伤对胫骨前肌AMPKα蛋白表达无影响（p>0.05）。（4）烫伤后1d，AMPKα2mRNA表达明显低于对照组（p<0.01）。（5）烫伤后6h，LKB1 mRNA水平较对照组上调（p<0.01），其后下降，于3d和5d明显低于对照组（p<0.01），7d有所回升。（6）烫伤后6h、1d、5d和7d，AMP/ATP比值较对照组升高（p<0.01），而EC较对照组降低（p<0.01或p<0.05）。
　　 2.（1）烫伤大鼠血清孵育L6肌管24h显著上调MAFbx和MuR目的mRNA表达（p<0.05）。（2）与10％SS组比较，10％BS组L6肌管AMPKα蛋白表达显著下降（30min、1h、6h，p<0.01），而AMPKa磷酸化水平升高（1h、6h，p<0.05；24h，p<0.01）。（3）10％BS组L6肌管AMPKα1 mRNA表达于24h较10％SS组降低（p<0.01），AMPKα2 mRNA表达于1h、6h和24h均较10％SS组降低（p<0.05）。（4）10％BS组L6肌管LKB1 mRNA表达于24h较10％SS组升高（p<0.01），然而，烫伤大鼠血清对L6肌管AMP/ATP比值和EC无影响（p>0.05）。
　　 3.（1）AMPK活化剂AICAR以剂量依赖方式抑制MAFbx和MuRF1 mRNA表达，Compound C预处理可抑制AICAR对MuRF1基因表达的上调作用（p<0.01）。（2）AICAR以剂量依赖方式上调Akt（Ser473）和GSK3-β（Ser9）的磷酸化水平，与激活PI3K有关。（3）胰岛素以剂量依赖的方式下调MAFbx和MuRF1 mRNA表达，AICAR能够逆转胰岛素对MAFbx和MuRF1 mRNA表达的抑制作用（p<0.01）。（4）胰岛素以剂量依赖方式去磷酸化抑制AMPK，其机制为通过激活Akt实现。（5）胰岛素以剂量依赖方式抑制肌管LKB1 mRNA表达，而对AME/ArP和EC无显著影响（p>0.05）。
　　 结论：烫伤大鼠骨骼肌能量状态的下降激活AMPK，AMPK的活化上调骨骼肌泛素E3连接酶的基因表达，蛋白分解增强。AMPK与蛋白代谢密切相关的胰岛素信号通路相互作用，AMPK激活Akt，而胰岛素抑制AMPK，胰岛素下调蛋白分解代谢的可能机制之一为抑制AMPK。因此，烫伤后骨骼肌AMPK的活化可促进蛋白分解代谢，针对AMPK的治疗措施可能是抑制烧伤后蛋白高分解的新靶点。

目录

文摘

英文文摘

基金项目

英文缩略词表

第一部分 烫伤大鼠骨骼肌蛋白分解、能荷和AMPK的变化

前言

材料与方法

一、主要仪器

二、主要试剂和试剂盒

三、主要试剂的配制

四、动物实验

五、HE染色

六、实时定量PCR

七、Western blotting

八、高效液相色谱法

九、统计学处理

结 果

一、大鼠体重和骨骼肌重量

二、大鼠胫骨前肌MAFbx和MuRF1 mRNA表达

三、大鼠胫骨前肌AMPK及其相关分子

讨论

一、烫伤引起大鼠骨骼肌萎缩的特点及其危害

二、骨骼肌萎缩发生的机制

三、烫伤后骨骼肌能量代谢与AMPK的变化

四、烫伤后骨骼肌能量状态、AMPK和泛素E3连接酶表达变化的关系

小 结

参考文献

第二部分 烫伤大鼠血清对L6肌管蛋白分解、能荷和AMPK的影响

前言

材料与方法

一、主要仪器

二、主要试剂和试剂盒

三、主要试剂的配制

四、动物实验

五、L6成肌细胞的培养、分化和鉴定

六、细胞分组和处理

七、Q-PCR

八、Western blotting

九、HPLC

十、统计学处理

结 果

一、L6肌管MAFbx和MuRF1 mRNA表达

二、L6肌管AMPK及其相关分子

讨论

一、细胞实验条件的选择

二、烫伤大鼠血清促进AMPK的活化及MAFbx和MuRF1目的表达

小 结

参考文献

第三部分 L6肌管AMPK与胰岛素信号通路分子的相互作用及对蛋白分解的调节作用

前言

材料与方法

一、主要仪器

二、主要试剂和试剂盒

三、主要试剂的配制

四、L6成肌细胞的培养和分化

五、细胞分组和处理

六、Western blotting

七、Q-PCR

八、HPLC

九、统计学处理

结 果

一、AMPK的激活对L6肌管MAFbx和MuRF1 mRNA表达的影响

二、AMPK的激活对L6肌管胰岛素信号通路分子Akt的影响

三、胰岛素对L6肌管MAFbx、MuRF1和AMPK的影响

讨论

一、AMPK的激活和抑制条件

二、AMPK的靶向分子

三、AMPK与蛋白质代谢调节通路

四、胰岛素调节蛋白质代谢的分子机制

五、AMPK与胰岛素信号通路的关系

小 结

参考文献

Review

Reference