钛支架人工角膜生物相容性的临床和实验研究

摘要

目的：
　　 评价现有钛支架人工角膜的组织相容性,研究气浮沉积(aerosol deposition,AD)技术制备的纳米级羟基磷灰石涂层对钛支架材料组织结合力、角膜成纤维细胞生物学行为以及角膜组织植入反应的影响。
　　 方法：
　　 1.回顾性病例研究。选择2000年1月至2009年12月间在解放军总医院进行人工角膜植入手术的患者85例(85只眼)。术后对支架前层组织和镜柱前后表面进行临床观察。对手术切除的人工角膜PMMA填芯前后组织以及柱镜表面增生膜进行病理分析。
　　 2.采用钛箔制备10x40mm的长方形植入材料样品36个,平均分3组,组1和组2分别应用气浮沉积(aerosol deposition,AD)技术和离子束辅助沉积(Ionbeam assisted deposition,IBAD)技术在纯钛表面制备羟基磷灰石涂层,组3为对照组。每组各取2个材料样品分别应用扫描电子显微镜和原子力显微镜进行HA涂层的表面分析。将其余24个材料随机植入12只家兔双侧背部肌肉组织。2月后,取出样品及周围组织进行拉伸试验,记录各样品拉伸试验的最大载荷,分别对所得的钛片和周围肌肉组织进行超微结构和组织学观察。
　　 3.将钛箔制备成10X10mm的正方形植入材料样品,平均分3组,制备HA涂层同前,应用兔角膜成纤维细胞作为实验细胞,通过扫描电镜观察材料表面细胞的生长形态,通过划痕愈合试验比较细胞移行能力,应用MTT试验检测24h、48h、72h和96h细胞的增殖能力。分别应用RT-PCR和流式细胞术评价检测整合素β4在基因和蛋白水平的表达,采用罗丹明-鬼笔环肽染色,观察各组材料表面细胞骨架蛋白的状态。
　　 4.将钛箔制做成直径3mm的圆形植入材料样品(24个),平均分2组,实验组表面应用AD技术制备HA涂层,对照组表面为不带涂层的纯钛。采用完全随机分组设计,将24只家兔分为实验组和对照组,全麻下将样品植入角膜旁中央部的基质层间。每组随机选取6只家兔进行临床观察,应用前节OCT对植入物前角膜厚度进行动态分析,其余6只于1w,4w,12w取材,进行角膜病理检查。
　　 结果：
　　 1.临床随访显示37.6％(32/85)患者出现角膜基质溶解。25.9％(22/85)患者出现镜柱表面组织增生,其中7例由于增殖膜较厚,在手术显微镜下接受了前膜切除手术。组织学上,PMMA填芯前后组织可见慢性炎症细胞,前膜组织由增生的上皮和纤维血管组织组成,伴间质慢性炎症。在上皮层,细胞核PCNA表达增多、增强,在基质中CD45R0(+)的T淋巴细胞、CD11c(+)的树突状细胞和CD68(+)巨噬细胞数量增多。17.6％(15/85)患者发生了人工角膜后膜。
　　 2.带有羟基磷灰石涂层的植入物组拉力负荷明显增高,AD组植入物与组织结合最为紧密(P<0.01)。
　　 3.兔角膜成纤维细胞在各组材料表面生长状态良好,未见细胞毒性反应。AD组细胞伸展状态和细胞移行能力最好,对照组相比,细胞增殖能力差异不显著。AD方法处理的材料表面细胞黏附因子整合素β4的基因和蛋白表达水平明显升高。
　　 4.带有AD方法制备的HA涂层的植入物在角膜内存留稳定,对照组材料植入物前板层角膜出现薄变(P<0.01),个别样品发生了暴露。病理显示HA-Ti在角膜组织耐受性好,未见异物反应。
　　 结论：
　　 1.前板层角膜溶解是钛支架人工角膜术后常见而危险的并发症。
　　 2.AD方法制备的纳米羟基磷灰石涂层能够增强钛与软组织之间的组织结合力。
　　 3.AD组羟基磷灰石涂层能够促进兔角膜成纤维细胞在材料表面的伸展、移行以及黏附因子的表达。在细胞水平,纳米羟基磷灰石涂层使材料的生物活性提高。
　　 4.AD方法制备的HA-Ti支架材料在眼内具有较好的组织相容性。