原发性肝癌实验室检测及相关辅助诊断技术研究

摘要

目的：研究HCC及其他肝脏疾病的血清蛋白谱的差异,试图建立高灵敏、高特异的各类肝病诊断模式,筛选新的标记物。
　　 方法：收集原发性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)153例、肝硬化(liver cirrhosis,LC)95例、肝炎115例、肝内胆管癌(intra-hepaticcholangio-carcinoma,ICC)15例、肝腺癌转移癌(metastatic cancer from adenocarcinomas,MC)30例、局灶结节增生(focal nodular hyperplasia,FNH)6例、血管瘤12例及健康对照组109例血清及数据建立临床数据库,流行病学调查及统计学分析肝癌及其他肝病组临床实验室指标的差异；ELISA方法检测血清中GP73(Golgi protein73)水平；生物信息学线性SVM算法及十折交叉确认法对肝功指标ALT、AST、肝癌标记物AFP及GP73进行生物信息学分析。外周血清用MB-WCX磁珠处理后,Clinprot/基质辅助激光解离时间飞行质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time ofFlight Mass Spectrometry,MALDI—TOF—MS)进行蛋白多肽的分离,结合生物信息学技术分析；纯化蛋白采用傅立叶变换离子回旋共振质谱仪鉴定。
　　 结果：⑴建立临床数据库；提取肝病相关实验室指标19项,原发性肝癌19项指标与其他疾病组均有差异；建立了鉴别诊断肝癌与肝硬化的模型,灵敏度与特异分别达到85.2％、84.2％。⑵肝硬化患者中GP73血清中位数水平显著高于肝癌及肝炎患者血清水平(P=0.001),这三组的GP73水平又显著高于健康人群(P<0.001)；在区分肝癌与肝硬化时,复合指标AFP/GP73的曲线下面积(Area under the receiver operating curve,AUROC)达到0.844(灵敏度达75.8％,特异度达79.7％),在鉴别早期肝癌时,AFP/GP73的AUROC为0.804。sGP73在血管瘤、局灶结节增生、肝内胆管癌和腺癌转移癌中的阳性率分别为0％、50％、63.3％、53.3％。⑶区分疾病组与正常组时,ALT+AFP+GP73结合时准确率最高,平均准确率为85.35％；ALT+AST+AFP+GP73结合时区分肝炎组与肝硬化/肝癌组的准确率最高,平均准确率为79.77％;AST+AFP+GP73结合时区分HCC、LC组准确率最高,平均准确率为88.26％。⑷由2882.89 Da、4476.12 Da两条多肽组成的特异模型可鉴别HBV感染人群与健康人群,灵敏度与特异度可分别达到95.5％、95.4％,40/56的HBV感染组与43/50健康组可被准确分组。2882.89 Da、4476.12Da峰被鉴定为beta-纤维蛋白原(fibrinogen beta chain,FBG)与核磷蛋白(nucleophosmin,NPM),当区分AsC与健康人群时其ROC曲线下面积均达到0.88。⑸AFP(+)与(-)HCC组间多肽谱差异较小；m/z3508 Da与2954 Da在AFP(-)HCC与LC组间显示出巨大差异(P<0.05)；3508Da峰与2954峰的曲线下面积分别为0.87、0.82。我们采用生物信息学SNN算法建立了诊断模型,其识别率达86.37％,预测率达70.29％。⑹建立的针对区分HCC与ICC组的诊断模型验证的总识别率达97.02％,但预测率低,仅67.51％；建立HCC与良性肿瘤组的诊断模型总识别率达81.44％,预测率低为73.65％；HCC与复发转移组间的诊断模型总识别率达92.59％,预测率为62.02％。
　　 结论：以肝脏疾病临床资料数据库为基础,生物信息学、临床数据与蛋白组学技术结合,可建立更简便的临床诊断模型。同时筛选了GP73及FBG、NPM肝病相关特异指标,结果有待进一步验证。