小分子化合物J2作用于大鼠角膜细胞的体外及体内实验研究

摘要

目的：通过原代培养获得SD大鼠角膜上皮细胞及内皮细胞,应用MTT检测方法研究小分子化合物J2对角膜上皮/内皮细胞的毒性作用,运用流式细胞分析技术检测小分子化合物J2作用后角膜上皮/内皮细胞膜表面CD80分子表达的变化情况,同时应用原子力显微镜观测该化合物对角膜上皮/内皮细胞膜表面超微结构的影响。建立大鼠角膜移植动物模型,在体内观测小分子化合物J2抗移植排斥反应的效果,应用AFM观测该化合物对角膜内皮层细胞超微结构的影响。
　　 方法：⑴5只SPF级SD大鼠,2％戊巴比妥钠按0.2ml/100g,腹腔麻醉。完整摘除健康大鼠眼球,取下角膜上皮/内皮组织,应用贴壁消化培养法培养角膜上皮/内皮细胞,经免疫组织化学方法鉴定。⑵按照MTT比色实验步骤,接种细胞于96孔培养板,培养过夜后,加入小分子化合物J2,于不同观测时间(10min,20min,30min,1h,2h,4h,8h,16h,32h,48h),终止实验,每板均设空白对照孔,选择490nm波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值,记录结果。所选实验终止点结束时,对不同观测时间的角膜上皮/内皮细胞应用透射电镜观察小分子化合物J2对细胞形态及细胞内各种细胞器的影响。⑶取每只SD大鼠肠系膜下静脉血约5ml,共15只。经密度梯度离心分离法获得单个核细胞,与角膜上皮细胞共培养,加入20000U/L IL-2,500000U/L IFN-γ细胞因子。实验分为三组:A组=MNCs+角膜上皮细胞+小分子化合物J2;B组=MNCs+角膜上皮细胞;C组=角膜上皮细胞(空白对照组)(各实验组均为2ml/培养瓶,共5例,总共10ml)。⑷将各组处理好的细胞用流式细胞仪检测CD80分子表达的荧光强度,首先调整细胞密度为1×106/mL,随后进行CD80免疫荧光标记,加入羊抗鼠单克隆抗体工作液0.1mL,室温孵育30min,洗涤1次,弃上清,加入兔抗羊FITC-IgG二抗工作液100μL,避光室温孵育30min,经洗涤弃上清液以除去未结合的荧光二抗,上机进行检测,并设二抗FITC的阴性对照。⑸AFM样品的制备和观测:将三组处理好的细胞用PBS液冲洗三遍,以三蒸水浸泡30min,以除去细胞表面残留杂质。2.5％戊二醛溶液固定20min,超净台空间下自然晾干。采用氮化硅探针,100Lm扫描器,悬臂针尖曲率半径10nm,力常数约为10mN/m。应用AFM观测三组细胞膜表面超微结构的改变,以及小分子化合物J2对细胞膜的影响。观测指标为Ra、Rq、Rvm、Rt。⑹以同样的方法和步骤对角膜内皮细胞进行MTT实验方法的检测、流式细胞技术分析及原子力显微镜观测。⑺建立大鼠同种异体角膜移植动物模型,随机分为三组。A组为小分子化合物J2药物实验组,B组为CsA药物对照组,C组安慰剂对照组。每日滴药次数相同,为4次/d。每日裂隙灯下观察植片情况,根据角膜新生血管评分及植片混浊评分标准判定植片存活时间。免疫组织化学方法测定植片CD80分子表达含量,AFM观测三组角膜植片内皮层细胞超微结构的区别及变化情况。
　　 结果：①经HE染色及免疫组化鉴定,本实验第一部分已成功获得原代培养的SD大鼠的角膜上皮/内皮细胞。角膜上皮细胞形态为长梭形,角膜内皮细胞则呈多角形。②应用MTT实验方法,测出小分子化合物J2对角膜上皮细胞的IC50值为:10min(4.43±0.59mmol/L),20min(4.40±0.51mmol/L),30min(4.31±0.48mmol/L),1h(4.17±0.45mmol/L),2h(4.15±0.46mmol/L),4h(4.14±0.48mmol/L),8h(4.12±0.43mmol/L),16h(4.09±0.45mmol/L),32h(4.04±0.44mmol/L),48h(4.03±0.47mmol/L)。透射电子显微镜可观察到:10mmol/L小分子化合物J2作用30min后角膜上皮细胞的形态由长梭形变为肿胀的圆形,细胞膜表面微绒毛大量脱落,胞内细胞器可见大量空泡形成,线粒体膨胀,伴随内嵴消失;粗面内质网的颗粒脱落消失。③经流式细胞分析仪检测,A组角膜上皮细胞CD80分子荧光指数为1.944±0.237,B组为3.128±0.175,C组为1.082±0.120。经单因素方差分析,具有统计学方面的差异(F=156.307,P<0.00)。经LSD-t检验各组之间差异均有统计学意义(P<0.05)。④应用MTT实验方法,测出小分子化合物J2对角膜内皮细胞的IC50值为:10min(3.20±0.33mmol/L),20min(2.97±0.28mmol/L),30min(2.88±0.26mmol/L),1h(2.68±0.25mmol/L),2h(2.59±0.26mmol/L),4h(2.58±0.14mmol/L),8h(2.53±0.17mmol/L),16h(2.45±0.11mmol/L),32h(2.44±0.21mmol/L),48h(2.43±0.28mmol/L)。透射电子显微镜可观察到:10mmol/L小分子化合物J2作用30min后角膜内皮细胞的形态多边形变为肿胀的椭圆形,细胞膜表面微绒毛大量脱落,胞核未见,可见大量空泡。⑤经流式细胞分析仪检测,A组角膜上皮细胞CD80分子荧光指数为2.132±0.173,B组为4.023±0.164,C组为0.985±0.118,经单因素方差分析,具有统计学方面差异(F=4989.799,P<0.00)。经LSD-t检验各组之间差异均有统计学意义(P<0.05)。⑥AFM观察角膜上皮细胞,呈长梭形,胞核的大小在14.07μm×20.04μm左右,整个细胞的长度在54.65μm左右,其高度在580-610nm左右。角膜内皮细胞,呈多边形,胞核的大小在17.28μm×20.43μm左右,整个细胞的长度在52.45μm左右,其高度在356nm左右。可发现两种细胞的表面总体较光滑,其表面超微结构显示颗粒状突起。无论是角膜上皮细胞,亦或角膜内皮细胞,经单因素方差分析比较三组Ra、Rq、Rvm、Rt值,认为三组之间存在统计学方面差异。⑦三组角膜植片的存活时间为:(A)28.73±0.37d,(B)31.47±0.57d,(C)16.60±0.42d,经Log-Rank分析,三组整体比较差异有统计学意义(F=60.788,P<0.00);经Log-Rank分析,控制混杂因素后对研究因素各水平间进行两两比较,发现A、B两组之间无统计学差异。经AFM观测可发现三组角膜植片内皮层细胞在超微结构上发生了改变。C组较A、B两组发生了更为显著的变化,A、B两组的观测值在某些数值上无统计学方面差异。
　　 结论：⑴小分子化合物J2对角膜上皮/内皮细胞的毒性作用并非与时间呈线性相关性,在前1h内,IC50值下降较明显。MTT测试的该结果,可为课题的下一步研究提供可靠的参考数据。⑵流式细胞分析检测角膜上皮细胞经MNCs活化,CD80分子存在高表达;经活化后的角膜上皮细胞,在小分子化合物J2作用下,CD80分子表达有所减少；在角膜内皮细胞测试上,也发现了同样的改变,提示小分子化合物J2可能通过与CD4+T细胞膜表面的CD4D1中的CDR3-CC’袋型结构相结合,阻止TCR与MHC-Ⅱ形成复合物,进而影响共刺激分子的表达,抑制或阻断免疫应答的活化,延缓角膜移植排斥反应的发生。⑶应用AFM可以观测到小分子化合物J2对角膜上皮/内皮细胞膜表面超微结构的改变,为AFM对细胞膜表面的观测提供更多更确切的表面信息,从另一层面增加小分子化合物J2对眼角膜上皮/内皮细胞影响的认识。⑷经动物模型体内实验进一步证明小分子化合物J2具有抗角膜移植排斥的作用,但与传统药物CsA相比,尚不能证明其作用优于传统药物,考虑为J2刺型以及药物在角膜层代谢动力学的问题,需在下一步的研究过程中进一步改善和探讨。应用AFM可以观测到角膜内皮层细胞在体内实验中超微结构的改变。