VEGF-A选择性剪接异构体VEGF156b抑制体外共培养系统中RF/6A细胞增殖的实验研究

摘要

背景：年龄相关性黄斑变性(age—related macular degeneration,AMD)是受到当今世界关注的老年人致盲性眼病,而脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)是渗出型 AMD的主要病理改变,也是AMD致盲的根本原因。缺氧在渗出型 AMD相关的CNV形成中起着重要作用。缺氧可以显著增加视网膜色素上皮(retinal pigment epithelia,RPE)细胞分泌血管内皮生长因子A(vasular endothelial growth factor A,VEGF—A),从而促进CNV生成。近年来的研究表明,VEGF-A依选择性剪接方式的不同,可形成具有促血管生成作用的VEGFxxx家族和具有抗血管生成作用的VEGFxxxb家族。VEGFxxxb家族蛋白在正常眼组织中表达,而在糖尿病视网膜病变患者的眼组织中表达水平降低。VEGF165b是VEGFxxxb家族中最早分离出来且研究最为广泛的分子结构,其在实验动物水平可以明显抑制角膜新生血管和视网膜新生血管的形成,而对视网膜生理性血管的发生无抑制作用。由于缺氧通过VEGF—A机制诱导CNV发生,那么,在CNV发生的过程中,VEGFxxxb家族是否在RPE细胞中表达,在缺氧状态的RPE细胞中表达是否变化,VEGF165b是否有抑制CNV形成的作用,如果能够抑制CNV形成又是通过什么机制等等一系列问题都值得进一步研究。
　　 目的：本研究拟以人RPE细胞系ARPE-19细胞为研究对象,模拟其缺氧状态,观察 VEGF165b对与ARPE-19细胞共培养的脉络膜内皮细胞系RF/6A细胞的影响,在体外实验水平上研究VEGF165b抑制CNV的可行性,为CNV的治疗新策略提供实验基础。
　　 方法：⑴化学诱导剂150μM氯化钴(CoCl2)模拟人RPE细胞系ARPE-19细胞缺氧状态,观察其缺氧后的细胞形态,Heochst染色计算细胞凋亡指数,MTT检测细胞活力,western blot检测缺氧诱导因子1α(Hypoxia induciblefactor1α,HIF-1α)证实ARPE-19细胞的缺氧模型成功建立。⑵在常氧和缺氧不同时间点的ARPE-19细胞,应用RT-PCR检测VEGFxxx和VEGFxxxb mRNA的表达,RQ-PCR定量检测VEGF165和VEGF165b mRNA的表达,Western blot检测总VEGF-A蛋白和VEGFxxxb蛋白表达,ELISA检测细胞上清中总VEGF-A蛋白和VEGFxxxb蛋白含量。⑶ARPE-19细胞与RF/6A细胞共培养检测VEGF165b对RF/6A细胞增殖和迁移的影响,划痕实验检测VEGF165b对ARPE-19-CM培养的RF/6A细胞迁移的影响,血管形成实验检测VEGF165b对ARPE-19-CM培养的RF/6A细胞的管腔结构形成的影响。⑷VEGF165b对缺氧ARPE-19细胞作用后,MTT法检测细胞活力,Westernblot检测HIF-1α蛋白相对表达含量及VEGF165b影响HIF-1α蛋白表达的机制,细胞免疫荧光观察HIF-1α蛋白定位变化,胞浆、核蛋白分别抽提的Western blot进一步验证VEGF165b对缺氧ARPE-19细胞HIF-1α蛋白的影响.
　　 结果：①ARPE-19细胞缺氧24 h细胞膜开始皱缩,72 h细胞膜断裂呈絮状,96 h细胞核固缩；细胞凋亡指数随缺氧时间延长而显著增加；细胞活力在缺氧24 h可维持在60.33％,48 h则显著降低至29.65％；0 h时检测不到HIF-1α蛋白的表达,缺氧3 h后可检测到HIF-1α表达,随着缺氧时间延长,HIF-1α蛋白表达量逐渐增加,24 h达到高峰,48 h HIF-1α蛋白表达则有所减少。②ARPE-19细胞常氧时在mRNA水平VEGFxxx家族和VEGFxxxb家族均有表达；缺氧后VEGF165mRNA的表达逐渐增加,而VEGF165b mRNA的表达则逐渐减少；常氧时蛋白水平可检测到VEGFxxxb,缺氧后VEGF165/VEGF165b蛋白的表达逐渐增加,而VEGF165b蛋白则逐渐减少；细胞上清VEGFxxxb蛋白含量由常氧时(166.82±2.55)pg/ml下降至缺氧24 h(125.35±2.10)pg/ml,而总VEGF—A蛋白则由(294.27±11.97)pg/ml上升至(582.26±12.98)pg/ml。③未经VEGF165b作用的RF/6A细胞与ARPE-19共培养24 h后缺氧组较常氧组RF/6A细胞的数量、细胞迁移距离、细胞迁移数量及形成管腔结构的长度显著增加,经VEGF165b作用后则比单纯缺氧组下降。④VEGF165b对缺氧24 h的ARPE-19细胞活力未产生显著影响,但可以在一定程度上提高缺氧48 h的ARPE-19细胞活力:40 ng/ml VEGF165b作用于缺氧ARPE-19细胞可使HIF-1α蛋白表达水平下降并呈剂量依赖性,加入蛋白酶体抑制剂MG132后HIF-1α蛋白含量显著增加；缺氧时HIF-1α蛋白进入胞核,经VEGF165b作用后核内HIF-1α绿色荧光强度减少；常氧时胞核和胞浆中均检测不到HIF-1α蛋白,缺氧后HIF-1α表达主要分布在胞核,经VEGF165b作用后胞核中的HIF-1α减少,加入MG132后,胞核中的HIF-1α蛋白增加。
　　 结论：⑴HIF-1α蛋白表达证实加入化学诱导剂CoCl2模拟ARPE-19细胞体外缺氧模型成功构建。在后续部分实验中,可采用ARPE-19细胞缺氧24h作为观察细胞反应差异的关键时间点。⑵ARPE-19细胞内有VEGFxxxb mRNA表达,常氧时VEGF165mRNA和VEGF165bmRNA的表达水平相当,缺氧后VEGF165 mRNA的表达水平逐渐增加而VEGF165bmRNA的表达水平则逐渐降低。ARPE-19细胞内VEGFxxxb蛋白表达以VEGF165b表达最强。缺氧后VEGF165b蛋白在VEGF165/VEGF165b蛋白所占比例下降。常氧时总VEGF-A蛋白以VEGFxxxb占主导,缺氧后VEGFxxxb占总VEGF-A比例下降。⑶VEGF165b有抑制与缺氧ARPE-19细胞共培养的RF/6A细胞增殖、迁移及管腔形成作用。⑷VEGF165b可能对缺氧的ARPE-19细胞在一定范围内和一定程度上起到保护作用。VEGF165b可减少缺氧ARPE-19细胞中的HIF-1α蛋白的表达。VEGF165b通过诱导缺氧ARPE-19细胞中的蛋白酶体降解HIF-1α使HIF-1α蛋白的水平下调。