胃癌中化疗敏感性相关基因甲基化、LRP16和NF-κB活性的研究

摘要

背景：胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一,其死亡率在世界范围内列居第二位,尤其在东亚和欧洲国家高发。胃癌预后较差,即使实施胃切除术后,60％的进展期胃癌患者将发生局部复发或远处转移。因此,胃癌术后辅助化疗已被广泛接受。表观遗传改变是指可遗传的基因表达改变,而不牵涉DNA序列的改变。目前研究显示,表观遗传学的改变可能是导致化疗抵抗的巨大推动力。本课题主要研究化疗敏感性相关基因启动子甲基化与胃癌预后的关系,化疗药效和表观遗传指标相结合,试图为胃癌术后辅助化疗患者的合理用药提供依据。核因子κB(Nuclear factorκB,NF-κB)通过调控下游靶基因的表达而参与细胞周期的调控、肿瘤的形成和进展等过程。虽然已证实NF-κB需经胞浆转入胞核而执行其功能,但N-κB激活的分子机制仍不清。LRP16作为macrodomain蛋白家族的一员,是雌激素受体(estrogen receptor,ER)和雄激素受体(androgen receptor,AR)的共活化物,可能在NF—κB激活过程中起着重要作用,本研究为排除NF-κB和其它转录因子,如ERα和AR之间复杂的交互作用,在非激素依赖性肿瘤胃癌中探讨LRP16和NF-κB活性的关系。
　　 目的：⑴在胃癌的发生过程中表观遗传学的作用越来越受到人们的重视,特别是DNA甲基化的临床价值已被广泛接受。本实验通过检测化疗敏感性相关基因启动子区CpG岛在胃癌组织中的甲基化水平,探讨这些基因启动子甲基化与胃癌患者预后及化疗敏感性的关系。⑵NF-κB信号通路在肿瘤的发生发展中起着非常重要的作用,它可以调控细胞的增殖、抑制凋亡、促进转移与血管生成,本课题在既往研究的基础上,探讨胃癌中LRP16和NF-κB活性在核内的相互作用,为寻找抑制NF-κB过度激活的靶点提供帮助。
　　 方法：①收集胃癌石蜡组织102例,常规酚/氯仿法抽提组织标本的基因组DNA,经过亚硫氢酸盐处理,采用甲基化特异性PCR(Methylation specific PCR,MSP)方法检测标本中CHFR、FANCF、MLH1、MGMT和RASSF1A基因启动子CpG岛甲基化的状况；采用PV6000二步法检测胃癌相关标志物MLH1、Ki-67和P53在胃癌组织中的表达情况,并分析甲基化程度、蛋白表达水平与临床参数之间的关系。②在293T细胞中,Superfect试剂转染pCDNA3.1-LRP16质粒、pCDNA3.1-p65和κB—luc,空载体质粒做对照。转染42小时后,用TNF-α或IL-1β刺激细胞,作用7小时后裂解细胞,通过双荧光素酶报告系统检测κB的相对活性；Western Blot方法检测LRP16蛋白的表达情况.利用ReadyPrepTM蛋白提取试剂盒从胃癌组织中提取总蛋白,酶联接免疫吸附剂测定法(enzyme-linkedimmunosorbent assay-based,ELISA)检测NF-κB的DNA结合活性.采用免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)检测胃癌组织中LRP16蛋白的表达。
　　 结果：⑴102例胃癌组织中FANCF基因无甲基化发生,CHFR、MLH1、MGMT和RASSF1A四个基因的甲基化发生率分别是:34.3％(35/102)、21.6％(22/12)、9.8％(10/102)和12.7％(13/102)。胃癌患者中CHFR基因启动子区的甲基化程度与淋巴结转移具有相关性(p<0.05)；CHFR无甲基化组的无瘤生存(relapsefree survival,RFS)好于甲基化组；无甲基化组对多西他赛(Docetaxel,TXT)为主的辅助化疗敏感性强于甲基化组(p<0.05).MLH1无甲基化组的总体生存(overall survival,OS)好于甲基化组；无甲基化组对奥沙利铂(Oxaliplatin,OXA)为主的辅助化疗敏感性强于甲基化组(p<0.05)。MLH1,Ki-67和P53在胃癌组织中的表达率分别为39.2％、69.6％和51.0％。P53蛋白表达阴性组对OXA为主的辅助化疗敏感性强于阳性组(p<0.05)。⑵在LRP16过表达的293T细胞中,TNF-α或IL-1β刺激后,κB的荧光素酶活性值增加到了1.5倍；在LRP16过表达的293T细胞中,单独转染p65真核表达载体亦能增加NF-κB的转录活性.在胃癌组织中LRP16核表达与NF-κB活性呈正相关(r=0.326,P=0.014)；LRP16阳性表达组的NF-κB活性(OD值=0.316±0.042)高于LRP16阴性表达组(OD值=0.288±0.036)(t=31.64,P=0.012)。
　　 结论：①在胃癌的发生过程中CHFR、MLH1基因甲基化及P53蛋白表达起着非常重要的作用,其变化可能不仅能用于胃癌的预后,而且能用于化疗敏感性的监测。②LRP16是NF-κB功能活性执行重要的核内辅助激活因子,在NF-κB激活过程中发挥着重要的作用,细胞核内LRP16的异常累积可能成为抑制NF-κB过度激活的一个治疗靶点。