两种新型竹红菌乙素衍生物的细胞吸收规律及光动力杀伤效应研究

摘要

目的：
　　通过研究两种新型光敏剂17-5-氨基-1-戊磺酸竹红菌乙素衍生物(PENSHB)和15-脱乙酰基13-3-氨基-1-丙磺酸竹红菌乙素衍生物(DPROHB)在人胃腺癌细胞BGC-823中的吸收特性和细胞内分布情况、光动力效应对细胞和线粒体的损伤规律及其暗毒性和安全性，初步了解这两种新型光敏剂在细胞水平的吸收特点、光动力效应及其安全性。
　　方法与结果：
　　(1)竹红菌乙素衍生物PENSHB、DPROHB在BGC-823细胞中吸收特性的研究。以浓度为4μM的PENSHB、DPROHB溶液分别孵育人胃腺癌BGC-823细胞0、0.5、1、2、4和8 h，用荧光分光光度计测定细胞裂解液中的荧光强度，通过荧光强度-浓度标准曲线计算出光敏剂在细胞中的含量，并绘制每种光敏剂的孵育时间-细胞含量关系曲线。以浓度为0.5、1、2、4和8μM的两种光敏剂分别孵育BGC-823细胞4 h，测定细胞裂解液中的光敏剂荧光强度，绘制孵育浓度-细胞含量曲线。结果显示，BGC-823细胞对PENSHB和DPROHB的吸收随孵育时间的延长而增加，1h内细胞吸收较快，4h达到平台，变化趋势两种光敏剂相近。在本实验的浓度范围内BGC-823细胞对PENSHB和DPROHB的吸收随孵育浓度的增高而增加，基本呈线性关系，上升趋势两种光敏剂相似。可见BGC-823细胞对PENSHB、DPROHB的吸收量依赖于光敏剂孵育时间及孵育浓度。
　　(2)PENSHB、DPROHB和HB在BGC-823细胞内的分布及线粒体损伤研究。在避光条件下，采用浓度为200 nM的Mito-Tracker Green(线粒体绿色荧光探针)孵育细胞30 min标记线粒体，浓度为4μM的光敏剂PENSHB、DPROHB、HB分别孵育BGC-823细胞1h、4h。激光共聚焦显微镜采集图像，观察光敏剂在细胞内的分布情况。并对光动力作用后线粒体的损伤效应进行了观察。结果显示，三种光敏剂孵育细胞1h、4h后，广泛分布于细胞胞质内，其中能定位于线粒体上，但均不进入细胞核；孵育4h时，光敏剂在细胞内荧光强度较1h强，在细胞核周围聚集程度增加，PDT作用后可引起线粒体损伤，并产生大量活性氧，PENSHB、DPROHB作用强于HB。
　　(3)PENSHB、DPROHB和HB对BGC-823细胞的光动力杀伤效应及暗毒性研究。光毒组(PDT组)：用不同浓度的PENSHB、DPROHB、HB分别孵育BGC-823细胞4h后，采用波长为532 nm激光，功率密度20 mW/cm2，照射1000 s。暗毒组(单纯光敏剂组)：仅光敏剂孵育24h，不予激光照射。用MTT法分别测定各组细胞的存活率。绘制光敏剂对细胞光毒及暗毒的杀伤曲线，拟合曲线方程，计算光动力半数杀伤浓度(IC50-PDT)及暗毒半数杀伤浓度(IC50-DT)，并依此计算光敏剂的安全系数。结果显示，PENSHB、DPROHB及HB对BGC-823细胞的光毒半数杀伤浓度(IC50-PDT)分别为26.47、27.33、47.30 nM；PENSHB和DPROHB的IC50-PDT显著低于HB的IC50-PDT(P<0.01)，而PENSHB与DPROHB的IC50-PDT相比差异无显著性(P>0.05)，提示PENSHB和DPROHB的光动力作用强度相似，两者均明显高于HB。PENSHB、DPROHB及HB的暗毒半数杀伤浓度(IC50-DT)分别为3.32、4.03、4.06μM，三者间差异无显著性(P>0.05)，提示三者本身(即在不照光条件下)均无明显细胞毒性作用。PENSHB、DPROHB及HB的安全系数依次为125.43、147.46、85.84，提示两种新型光敏剂均较HB更加安全有效。
　　结论:
　　通过分子修饰的两种新型竹红菌乙素衍生物PENSHB和DPROHB的理化特性得到优化，能被体外培养的BGC-823细胞快速吸收，广泛分布于细胞质内和线粒体，其吸收量与孵育浓度和时间呈正相关；对BGC-823细胞株的PDT杀伤作用较其母体HB明显增强、暗毒性无显著差异、安全性明显提高。研究结果表明，PENSHB和DPROHB是较HB更加安全有效的新型光敏剂，具有良好的应用开发前景。

目录

文摘

英文文摘

缩略词表

前 言

第一部分 人胃腺癌BGC-823细胞对竹红菌乙素衍生物PENSHB、DPROHB的吸收特性研究

引言

材料与方法

结 果

讨论

小 结

第二部分 PENSHB和DPROHB在BGC-823细胞中分布及线粒体定位和损伤的研究

引言

材料与方法

结果

讨 论

小 结

第三部分 PENSHB和DPROHB对BGC-823细胞的光动力杀伤效应及暗毒性研究

引言

材料与方法

结果

讨 论

小 结

结论与展望

创新点

参考文献

文献综述

参考文献

攻读硕士学位期间发表文章

致谢