电针预处理改善心肌缺血性损伤的β-肾上腺素能受体信号转导机制

摘要

心肌缺血性疾病是世界范围内死亡率最高的疾病之一。过去的临床和实验工作表明，针刺可以改善心肌缺血引起的心电图ST段的改变，缓解心绞痛。但由于心肌缺血性疾病(如冠心病等)发病凶险，死亡率较高，一般急性发作病人很少来针灸科治疗，使得针灸在该病的治疗上难以发挥作用。然而，过去有关针灸方面的研究工作却提示，针灸可能对于冠心病、心肌缺血具有未病先防的作用，即，预防或减轻冠心病的发病。因此，探讨一条合适的途径来发挥针刺在防治冠心病心肌缺血性损害的作用具有重要的临床意义和科学价值。 大量研究证实：心肌缺血性损害可以引发心脏交感神经过度兴奋以及心脏对交感神经兴奋性调节的反应性增强。继而引起β1-肾上腺素能受体(β1-AR)过度兴奋，经一系列信号转导机制，最终导致心肌细胞内钙超载等因素有关。而适当提高交感神经兴奋性对心肌缺血具有保护作用，如采用心脏肾上腺素能受体及其信号转导成分激动剂预处理方法，可以改善其后较长时间的心肌缺血导致的心肌损伤。而过去有关针灸方面的研究工作显示，针刺可直接提高交感神经的兴奋性。因此，针刺极有可能通过影响交感神经系统，进而作用于心脏β1-AR及其受体后的信号转导通路，从而象受体激动剂预处理一样，起到改善缺血性心肌损害的作用。然而，迄今这方面的研究工作尚未见报道。 本项研究采用结扎和再灌大鼠左冠状动脉前降支的方法建立实验性心肌局部缺血模型和离体心脏模拟全心缺血(低灌流)模型，探讨电针预处理对心肌缺血性损伤的保护作用，并深入阐明β1-AR及其受体后信号转导路径在介导电针预处理改善缺血性心肌损害中的作用。为针刺预防冠心病、心肌缺血及针刺的“治未病”的保健作用提供现代科学基础。 实验选用雄性成年Wister大鼠120只，体重278±25g；雄性成年Sprague-Dawley(SD)大鼠60只，体重255±17g。第一部分实验中将大鼠随机分为四组：正常对照组(NC组)、缺血再灌注组(IR组)、缺血再灌注+电针组(EA组)和缺血再灌注+电针+心得安组(EAP组)。EA组于每次麻醉后电针内关30min(电针参数：强度5mA，频率20Hz)，连续三天；EAP组于每次麻醉后先腹腔注射心得安(10mg/kg)，15min后再电针内关30min，连续三天。NC组、IR组仅于每次麻醉后捆绑30min，不做其他处理，连续三天。第二部分实验中将大鼠随机分为三组：NC组、IR组和EA组，各组预处理方法同前。 实验共分两部分进行：第一部分实验通过观察心电图ST段变化、心律失常评分、心肌梗塞范围测定、分离的心肌细胞存活率以及异丙肾上腺素(Isoproterenol，ISO)作用下单个心肌细胞内钙振荡([Ca2+]ioscillation)情况等指标来确定电针预处理的保护作用。第二部分实验通过观察β1-AR蛋白、Gsα蛋白、cAMP的变化，以及Forskolin(腺苷酸环化酶的激动剂)、8-Br-cAMP(蛋白激酶A的激动剂)、BayK-8644(L-型Ca2+通道的激动剂)等β1-AR信号转导成分激动剂的作用下，单个心肌细胞内游离Ca2+变化情况，探讨β1-AR及其受体后的信号转导通路上哪一或哪些信号分子参与介导电针预处理改善心肌缺血的保护作用。具体结果如下： 1.电针预处理改善心肌缺血性损伤疗效的确定1)心电图(ECG)ST段变化：结扎前NC，IR，EA和EAP组分别为：42.80±8.43，43.35±10.78，35.97±4.62和44.88±11.58μV，缺血期各组动物(NC组除外)的ST段均呈进行性抬高，至结扎30min到达峰值，IR，EA，EAP组分别为162.50±30.24，103.00±15.98和142.38±24.39μV，与正常组43.50±9.67μV比较，IR组ST段显著抬高(P＜0.01)，而与IR组比较，EA组ST段抬高幅度明显降低(P＜0.01)；各组再灌注10min后三组ST段均有不同程度的回落，IR组为：110.50±23.82μV，明显高于正常组44.19±10.55μV(P＜0.01)，仅有EA组逐步恢复至结扎前水平，为50.81±10.27μV，与IR组比较其抬高幅度明显降低(P＜0.01)；而EAP组于结扎30min142.38±24.39μV和再灌注10min93.19±19.21μV，其抬高幅度与IR组很接近，均明显高于EA组(P值均＜0.01)。 2)心律失常评分：IR组评分为3.17±1.17，明显高于NC组(P＜0.01)；EA组评分为1.10±0.99，明显低于IR组(P＜0.01)；EAP组心律失常评分为2.97±0.99，明显高于EA组(P＜0.01)。 3)梗塞范围测定：IR组梗塞范围为38.63±2.92﹪，EA组为21.51±1.73﹪，明显低于与IR组(P＜0.01)；而EAP组为36.62±3.70﹪，与IR组很接近，而明显高于EA组(P＜0.01)。4)心肌细胞存活率：NC组心肌细胞存活率为73.53±0.86﹪；而IR组存活率为22.80±0.78﹪，明显低于NC组(P＜0.01)；EA组为71.62±0.46﹪，明显高于IR组(P＜0.01)；而EAP组为24.41±0.67﹪，明显高于EA组(P＜0.01) 5)Isoproterenol(ISO)诱发的钙振荡：IR组心肌细胞在加入ISO(1×10-6mol/L)后出现了频繁的钙振荡；EA组心肌细胞在ISO作用下钙振荡的发生明显降低；而EAP组心肌细胞却在加入ISO后亦出现了频繁的钙振荡。 2.探讨β1-AR及其信号转导系统在电针预处理改善心肌缺血性损伤中的介导作用1)β1-AR蛋白变化：IR组β1-AR蛋白与NC组比较增加了40.78﹪(P＜0.01)，而EA组增加了11.93﹪，明显低于IR组(P＜0.01)。 2)Gsα蛋白变化：IR组Gsα-S和Gsα-L蛋白与NC组比较分别增加了37.86﹪(P＜0.01)和25.58﹪(P＜0.01)，而EA组仅分别增加了0.59﹪和1.92﹪，但均明显低于IR组(P＜0.01和P＜0.05)。 3)Forskolin作用下心肌细胞内钙瞬变情况：IR组缺血心肌细胞在Forskolin(5×10-7mol/L)激动下钙瞬变的波幅与Control相比较增加了157.87﹪(P＜0.01)，与相应的NC组增加的幅度(77.07﹪)比较明显增高(P＜0.01)，而EA组缺血心肌细胞在Forskolin作用下钙瞬变的增加的幅度为78.41﹪(P＜0.01)，与相应的IR组比较增加幅度明显降低(P＜0.01)。 4)心肌组织cAMP含量：NC组为0.36±0.07pmol/mL，而IR组为0.62±0.09pmol/mL，明显高于NC组(P＜0.01)，EA组为0.36±0.05pmol/mL，其含量明显低于与IR组(P＜0.01)。 5)8-Br-cAMP作用下心肌细胞内钙瞬变情况：IR组缺血心肌细胞在8-Br-cAMP(1×10-6mol/L)激动下钙瞬变的波幅与Control相比较增加了68.92﹪(P＜0.01)，与相应的NC组增加的幅度(54.15﹪)比较明显增高(P＜0.01)，而EA组缺血心肌细胞在8-Br-cAMP作用下钙瞬变的增加的幅度为57.36﹪(P＜0.01)，与相应的IR组比较增加幅度明显降低(P＜0.05)。 6)BayK-8644作用下心肌细胞内钙瞬变情况：IR组缺血心肌细胞在BayK-8644(5×10-7mol/L)激动下钙瞬变的波幅与Control相比较增加了78.02﹪(P＜0.01)，与相应的NC组增加的幅度(59.06﹪)比较明显增高(P＜0.01)，而EA组缺血心肌细胞在BayK-8644作用下钙瞬变的增加的幅度为62.17﹪(P＜0.01)，与相应的IR组比较增加幅度明显降低(P＜0.01)。 结论大鼠局部心肌缺血可造成ST段的过度抬高、心律失常发生率及心肌梗塞面积的异常增加；模拟全心缺血后，心肌细胞的存活率大大降低、并且导致ISO诱导的钙振荡现象频发。由本实验观察结果提示其损害机制表现为：缺血心肌细胞膜内β1-AR蛋白水平的异常增高，从而沿其信号转导路径引起Gsα蛋白水平和缺血心肌组织cAMP含量的过度增高，并导致心肌细胞对Forskolin(AC激动剂)、8-Br-cAMP(PKA激动剂)和BayK-8644(L-型Ca2+通道激动剂)作用下引起的细胞内游离钙变化的反应性均明显增强等一系列变化。可见β1-AR信号转导系统各个站点：β1-AR、Gsα、AC、cAMP、PKA和L-型Ca2+通道都参与介导了心肌缺血诱导的心肌损害和心脏功能障碍。 电针预处理可以有效地减低大鼠心肌缺血所引起的ST段的抬高；降低心肌梗塞面积；提高缺血心肌细胞的存活率；减少缺血性心脏心律失常的发生率；抑制缺血心肌细胞由ISO诱导的钙振荡，对随后的心肌缺血具有明确的保护作用。 电针预处理抗心肌缺血作用的机制可以归结为：电针预处理后通过反复的兴奋交感神经，继而作用于β1-AR信号转导系统的各个站点，产生β1-AR的下调和“脱敏”效应，通过β1-AR蛋白水平的下调，使其相偶联的Gsα蛋白水平亦有所下降，导致AC活性的减低、cAMP含量的下降，继而引起PKA以及L-型Ca2+通道活性的减低等一系列变化，从而降低因缺血等导致的心肌细胞内Ca2+的超载等损害。

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