血管老化相关内皮细胞衰老的机制研究与益气活血中药的干预作用

摘要

血管老化是促进心血管疾病发生的重要危险因素，随着我国老龄化社会的到来，对其进行深入的研究显得十分必要。血管内皮细胞不仅是血液与血管平滑肌之间的一层半通透性屏障，亦是一个活跃的内分泌器官，是全身和局部血流动力学功能及细胞增生调节的重要决定因素。研究已经表明，内皮细胞衰老是血管整体老化的重要病理改变之一：因此，内皮细胞一直是血管老化研究的重点领域。本课题组前期的相关研究取得了如下成果：AngⅡ的诱导从mRNA和蛋白水平上调AT1和NADPH氧化酶p22phox的表达，介导细胞内活性氧水平的增高，可能是血管内皮细胞衰老的主要机制之一；氧化应激在血管老化的发生、发展中有着重要的作用。同时，益气活血中药人参、三七、川芎组方能够有效降低AngⅡ信号通路的强度，减轻氧化应激损伤，具有显著的延缓血管内皮细胞衰老的作用；并且中药低剂量干预(20mg/L)的疗效更加突出。
　　增殖停滞被认为是细胞衰老的重要特征。人体衰老时组织器官的结构和功能退化均与其细胞数量的减少关系密切，而细胞增殖则是维持细胞数量的关键环节。衰老细胞的增殖障碍既受细胞外信号的调控，又必须通过细胞内信号级联反应的介导，而促使细胞周期的停滞。研究表明，细胞周期素依赖性激酶抑制因子(CDI)的表达能够明显抑制细胞的增殖，是衰老细胞处理各种信息并作出相应应答的主要方式之一，这种控制生长发育的基因在细胞生命晚期发挥作用可能是促使其衰老的主要原因。
　　过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)是核受体超家族成员之一，其主要在脂肪组织、内皮细胞以及免疫细胞中表达，参与脂肪细胞分化、血管内皮保护、及机体免疫调节等多项生命活动，是胰岛素增敏剂噻唑烷二酮类药物作用的靶分子，是近年来心血管药理研究的热点之一。现已表明，PPARγ可以直接作用于血管壁，阻断血管硬化的进程。同时，PPARγ办能够减轻血管内皮细胞的氧化应激损伤，促进其NO的合成与分泌，从而对内皮细胞发挥重要的代偿保护作用，并成为延缓血管老化和内皮细胞衰老的重要作用靶点。
　　研究指出老化血管的结构重塑和功能退化直接改变了各种心血管疾病的发生阈值、进展速度和严重程度，是导致心血管死亡率增高的主要原因之一。老化相关的血管硬化不同于局灶性的动脉粥样硬化，它不与临床上的梗塞、出血和动脉瘤等疾病直接相关，而表现为血管全程的管壁增厚、弹性降低和内腔扩大，与相关脏器的功能不全和衰竭关系更加密切。目前，评价血管老化程度最有临床价值的无创性检测方法是测定脉搏波传播速度(PWV)。血管老化促使血管壁增厚，僵硬度增加，顺应性降低，从而导致其PWV水平升高。国外研究指出，急性心肌梗死患者的PWV水平与其心血管死亡率密切相关，并且独立于先前的心血管疾病史、年龄和糖尿病等。
　　因此，在前期工作的基础上，本研究旨在进一步从内皮细胞衰老的角度研究血管老化的发生机制和益气活血中药干预的作用途径；并以STEMI为疾病平台，探讨血管老化的临床意义和中医舌象特征。首先，继续以AngⅡ诱导的衰老血管内皮细胞模型为研究对象，采用低剂量益气活血中药干预，以从细胞增殖调控的角度，探讨其衰老的内在机制和中药的干预作用；其次，以PPARγ为靶点，探讨其对衰老内皮细胞的代偿保护作用及其变化，并揭示益气活血中药干预的可能机制。再次，以PWV为检测指标，对血管老化与ST段抬高急性心肌梗死(STEMI)患者近期预后的相关性进行分层分析，并从舌诊的角度分析血管老化的中医特征。以期为血管老化的研究及中医药防治提供新理论、新视角和新靶点，也为将来从血管老化角度评估心血管疾病的预后提供新的思路。
　　本论文主要由基础研究、临床研究和文献综述所组成。
　　基础研究分为以下四个部分：
　　第一部分：AngⅡ诱导血管内皮细胞衰老的特征改变
　　目的：探讨AngⅡ诱导血管内皮细胞衰老的细胞学特征改变。
　　方法：从健康产妇分娩健康婴儿的脐带中分离、培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，作形态学和vWF荧光抗体染色鉴定，采用ECM完全培养基传代培养细胞至生长良好的第4代，同步化后进行实验，分为对照组和AngⅡ组(10-6mol/L)。选取AngⅡ诱导后的24h和48h点进行动态观察，运用荧光显微镜观察细胞形态的变化，采用β-半乳糖苷酶染色鉴定细胞的衰老，通过检测细胞培养上清中NO、eNOS的含量判断内皮细胞的功能状态；利用CCK-8和流式细胞周期检测评价细胞的增殖能力。
　　结果：与对照组相比，AngⅡ组随诱导时间的延长，其细胞数量减少，胞浆区域增大，细胞浆/细胞核比例增加，胞浆中可见较多颗粒或空泡；β-半乳糖苷酶阳性染色的细胞数量明显增加(p<0.01)；上清中NO和eNOS的含量明显下降(p<0.01)；CCK-8法检测的活细胞数量明显减少(p<0.01)；细胞大量停滞于G0/G1期，而S期和G2/M期逐渐消失(p<0.01)。AngⅡ组24h点与48h点比较，上述指标均有显著差异，48h点细胞的衰老特征更为明显(p<0.05)。
　　结论：AngⅡ诱导产生的衰老血管内皮细胞，其主要的细胞学特征包括功能障碍和增殖障碍。
　　第二部分：益气活血中药对血管内皮细胞衰老特征的干预作用
　　目的：验证益气活血中药人参、三七、川芎组方对衰老血管内皮细胞的干预作用。
　　方法：体外培养HUVECs，采用AngⅡ(10-6mol/L)、中药组方浸膏(20mg/L)和替米沙坦(10-6mol/L)干预，实验分为对照组、AngⅡ组(AngⅡ10-6mol/L)、中药浸膏组(中药20mg/L+AngⅡ10-6mol/L)和替米沙坦组(替米沙坦、AngⅡ10-6mol/L)。选取药物干预后的24h和48h点进行动态观察，采用MTT法检测干预药物的细胞毒性，通过β-半乳糖苷酶染色、培养上清NO、eNOS含量测定、CCK-8和流式细胞周期分析对药物的干预作用进行观察。
　　结果：实验浓度的中药浸膏和替米沙坦对HUVECs无明显毒性，细胞存活率均达97.0％以上。与AngⅡ组相比，在两个时间点，中药组和替米沙坦组的β-半乳糖苷酶阳性染色细胞数均明显下降(p<0.05)，细胞周期阻滞亦明显改善(p<0.05)。在24h点，中药组的NO、eNOS含量和CCK-8活细胞数量均明显增加(p<0.05)，而在48h点，替米沙坦组的上述指标增加明显(p<0.05)。中药组与替米沙坦组比较，在24h点，中药组的各项指标均优于替米沙坦组(p<0.05)；而在48h点，替米沙坦组的各项指标则较中药组为优(p<0.05)。
　　结论：益气活血中药人参、三七、川芎组方能够有效延缓AngⅡ诱导的血管内皮细胞衰老，部分恢复其增殖能力与内皮功能：并且中药在细胞衰老早期的干预作用更加明显。
　　第三部分：AngⅡ诱导血管内皮细胞衰老p53、p16基因表达及中药干预的研究
　　目的：探讨AngⅡ诱导血管内皮细胞衰老相关基因p53、p16INK4a的表达与益气活血中药的干预作用，进一步明确衰老内皮细胞发生增殖障碍的内在机制。
　　方法：体外培养HUVECs，实验分为对照组、AngⅡ组(AngⅡ10-6mol/L)、中药浸膏组(中药20mg/L+AngⅡ10-6mol/L)和替米沙坦组(替米沙坦、AngⅡ10-6mol/L)。利用免疫化学染色法观察AngⅡ诱导24h和48h细胞p53、p16INK4a缸阳性染色的情况；采用RT-PCR和Western-blot法分析各组细胞0、12h、24h、36h和48h的p53、p16INK4a mRNA和蛋白表达的时间效应关系。
　　结果：随AngⅡ诱导时间的延长，48h时p53、p16INK4a阳性染色的细胞数量较之24h明显增加，染色程度亦明显加深。AngⅡ呈时间依赖性上调p53、p16INK4a的mRNA和蛋白表达，其中p53的表达早于p16INK4a。中药和替米沙坦干预后，两组的p53、p16INK4a表达较之AngⅡ组均明显下调(p<0.05)；中药组与替米沙坦组比较，在24h点，中药抑制p53表达的作用更加明显(p<0.05)，而两者对p16INK4a表达的影响则无明显差异(p>0.05)；在48h点，替米沙坦对p53和p16INK4a表达的抑制作用均优于中药(p<0.05)。
　　结论：衰老血管内皮细胞的增殖障碍可能源于CDI基因p53、p16INK4a的异常表达上调；益气活血中药能够明显抑制CDI基因的表达，改善衰老细胞的增殖障碍，并且在衰老早期的作用更加明显。
　　第四部分：AngⅡ诱导血管内皮细胞衰老PPARγ基因的表达变化与中药干预的可能机制
　　目的：探讨PPARγ基因对衰老血管内皮细胞的代偿保护作用及其动态变化，进一步明确益气活血中药干预的可能机制。
　　方法：体外培养HUVECs，实验分为对照组、AngⅡ组(10-6mol/L)、中药浸膏组(中药20mg/L+AngⅡ10-6mol/L)、替米沙坦组(替米沙坦、AngⅡ10-6mol/L)、单纯阻断剂组(AngⅡ10-6mol/L+GW966210-5mol/L)和中药加阻断剂组(中药20mg/L+AngⅡ10-6mol/L+GW966210-5mol/L)。根据实验设计，分别采用RT-PCR和Western-blot法分析各组细胞0、12h、24h、36h和48h的PPARγ、p53、p16INK4a mRNA和蛋白表达的时间效应关系。
　　结果：AngⅡ呈时间依赖性上调内皮细胞的PPARγ mRNA表达；但其蛋白表达呈现出早升后降的趋势，从0点到24h表达逐渐上调，24h达高峰，从24h到48h表达逐渐下调；各时间点，中药组和替米沙坦组PPARγ的mRNA和蛋白表达均明显高于AngⅡ组(p<0.05)；其中，中药组在24h点的作用明显优于替米沙坦组(p<0.05)；而在36h和48h点，替米沙坦组的疗效优于中药组(p<0.05)。对单纯阻断剂组和AngⅡ组的p53、p16INK4a表达进行比较，前者各时间点的p53、p16INK4a表达均高于后者(p<0.05)，说明PPARγ对CDI基因具有调节作用。又通过对AngⅡ组、中药浸膏组和中药加阻断剂组p53、p16INK4a表达的比较，发现在多个时间点，中药加阻断剂组的p53、p16INK4a表达明显高于中药组(p<0.05)，而低于AngⅡ组(p<0.05)；说明中药的作用与PPARγ信号通路有关。
　　结论：PPARγ对血管内皮细胞衰老具有代偿保护的作用，除外抗氧化应激和促进NO合成，其亦能改善细胞的增殖障碍，机制可能与下调p53、p16的表达有关；在细胞衰老的晚期，PPARγ的作用降低与其翻译障碍有关。益气活血中药能够促进PPARγ的表达，改善其翻译障碍，并且部分依赖PPARγ信号通路的激活以实现延缓血管内皮细胞衰老的作用。
　　临床研究分为以下两个部分：
　　第一部分：不同血管老化水平对ST段抬高急性心肌梗死患者近期预后的影响
　　目的：探讨不同血管老化水平与ST段抬高急性心肌梗死(STEMI)患者近期病死率和不良心血管事件发生率的相关性。
　　方法：选择2005年至2008年间中国中医科学院望京医院心内科和清华大学第一医院心脏中心诊治的STEMI患者282例为研究对象。入选病例均接受STEMI的常规治疗，包括再灌注治疗和全面药物治疗，病例信息记录完整。所有患者均在STEMI发病后30天内进行过臂踝脉搏波速度(baPWV)检测。按照不同的baPWV水平分为4组，即PWV正常组(<1400cm/s)、PWV轻度升高组(PWV：1400-1900cm/s)、PWV中度升高组(PWV：1901-2400cm/s)和PWV重度升高组(PWV>2400cm/s)。分析不同PWV水平患者30天死亡、复发性心肌缺血、再次心肌梗死(再梗)、卒中、心源性休克以及包括上述事件的联合终点事件发生情况。
　　结果：单因素分析显示，患者的30天病死率、联合终点事件发生率随着PWV水平升高而逐渐增高；30天病死率的各组比较无显著差异(p>0.05)，PWV正常组为最低(2.5％)，PWV重度升高组为最高(13.0％)；30天联合终点事件发生率的各组比较差异显著(p<0.01)，PWV正常组的发生率仍为最低(2.5％)，而PWV重度升高组的发生率仍为最高(19.6％)。多因素logistic回归分析显示，PWV的中度和重度升高是STEMI患者30天死亡的独立相关因素，PWV重度升高患者的死亡危险较之正常者增加9倍以上(p=0.021，OR：9.242)；PWV的中度和重度升高办是STEMI患者30天发生联合终点事件的独立相关因素，PWV重度升高组30天联合终点事件的发生危险较之正常组增加5倍以上(p=0.014，OR：5.932)。
　　结论：PWV>1900cm/s能够显著增加STEMI患者30天的病死率和联合终点事件发生率；血管老化是STEMI患者近期不良预后的独立危险因素。
　　第二部分：STEMI患者不同血管老化水平与紫暗舌的相关性研究
　　目的：探讨STEMI患者不同血管老化水平与出现紫暗舌的相关性，揭示血管老化的中医舌象特征。
　　方法：病例选择与分组同第一部分。所有患者均从入院即刻开始，进行过连续的舌象采集和判断，一天一次，共7天。紫暗舌的鉴定综合中医舌诊图像分析系统和专家舌诊的结果共同作出。分析不同血管老化水平患者入院即刻、连续3天和连续7天紫暗舌的发生情况。
　　结果：单因素分析显示，患者入院即刻紫暗舌的出现率，各组未见明显差异(p>0.05)；连续3天紫暗舌的出现率，各组差异明显(p<0.001)，PWV正常组为最低(44.3％)，PWV重度升高组为最高(87.0％)；连续7天紫暗舌的发生率，各组亦有显著差异(p<0.001)，PWV正常组仍为最低(6.3％)，PWV重度升高组仍为最高(45.7％)。多因素logistic回归分析显示，PWV的中度和重度升高与STEMI患者连续7天出现紫暗舌的发生率具有独立相关性，PWV重度升高组连续7天出现紫暗舌的发生率较之正常组增加49.7％(p<0.01，OR：1.497)。
　　结论：PWV>1900 cm/s能够显著增加STEMI患者连续7天出现紫暗舌的发生率，二者具有独立的相关性；STEMI患者连续出现紫暗舌可能是血管老化的中医证候特征。
　　文献综述分别就血管老化的研究进展及中医认识，与PPARγ、p53、p16对血管内皮细胞衰老的调节作用两个方面进行了详细阐述。
　　综上所述，本研究分别从基础实验和临床观察两个方面对血管老化的发生机制、中医药防治靶点、临床意义以及中医舌象特征进行了深入的探讨。其中，基础实验着重研究了血管老化相关内皮细胞衰老的机制与益气活血中药的干预作用及途径。结果表明：衰老血管内皮细胞具有功能障碍和增殖障碍的特征；其增殖障碍主要源于CDI基因p53、p16的异常高表达；PPARγ是细胞衰老的重要代偿因子，但随着衰老的进展，由于蛋白的翻译障碍，致使其保护效应逐渐减弱。益气活血中药干预能够明显延缓血管内皮细胞的衰老，不仅抑制p53、p16的表达，也增加PPARγ的mRNA和蛋白表达，改善其翻译障碍。同时，进一步研究发现，PPARγ对内皮细胞衰老的影响，除了抗氧化应激和促进NO合成之外，还与抑制p53、p16的表达有关；并且益气活血中药的干预作用，可能部分通过激活PPARγ信号来实现。不仅如此，研究还提示益气活血中药的作用在细胞衰老过程的早期更为明显，可能对于血管老化的预防意义更大。本论文的临床研究则初步显示了血管老化与心血管疾病不良预后的相关性，并认为紫暗舌可能是血管老化的中医证候特征之一。总之，本研究的创新之处在于，从内皮细胞的增殖调控与代偿保护两个方面揭示了血管老化的发生机制与益气活血中药的干预靶点及途径；以动态观察的方式进一步明确了中药作用的时效规律；并通过多因素回归分析对血管老化与心血管疾病预后以及中医舌象特征的相关性进行了探讨。