白英生物碱对非小细胞肺癌的抑制作用及凝集脂筏胆固醇抑制血管新生的抗肿瘤机制研究

摘要

癌症严重危害人类生命健康，尤其是目前高居我国恶性肿瘤死因榜首的肺癌，其发病率仍在逐年不断提高。以非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)最为普遍，占肺癌总数80％～85％。并且约70％患者在确诊时已属中晚期，使得肺癌治疗变得更加困难。目前对于放化疗等的研究虽然日益深入，但针对NSCLC的治疗效果仍不容乐观，同时较强的毒副作用及抗药耐药性，给患者带来不小的痛苦。近几年来，随着肿瘤分子生物学领域的研究不断深入，以血管新生作为靶点探索抗肿瘤的途径及相关药物的研发也已成为治疗NSCLC的研究热点，肿瘤/肿瘤血管新生发生发展过程中一个关键连接点VEGF/VEGFR2就是其中一个重要的靶向治疗分子靶点。然而抑制肿瘤血管新生治疗因将VEGF及其受体或者血管新生通路中其他调控因子直接作为靶点而致使的突变等也已显示出一定的耐药性，研究人员正试图以多个靶点或者其他途径解决这个临床面临的难题。
　　肿瘤与肿瘤血管是相互依存关系，肿瘤细胞以及肿瘤血管内皮细胞的细胞膜构建都离不开胆固醇的参与。经大量相关文献检索发现，糖苷生物碱具有结合胆固醇（包括细胞膜脂筏胆固醇）形成不溶性复合物的特性，将其与调控胆固醇流出破坏细胞膜脂筏结构阻碍VEGF/VEGFR2结合从而抑制血管新生的最新研究进展结合，以及肿瘤血管新生学说进行关联性分析，设想通过结合肿瘤血管内皮细胞细胞膜胆固醇破坏细胞膜脂筏结构是否可达到抑制血管新生的作用，从而切断肿瘤的营养供给，使其无法继续生长并萎缩，继而达到抑瘤的效果。即提出“糖苷生物碱直接凝集脂筏胆固醇抑制血管新生的抗肿瘤机制”假说。
　　中药白英(Solanum lyratum)系茄科(Solanaceae)植物白英的干燥全草，最早见于《神农本草经》，并被列为上品，已有两千多年的应用历史。作为抗癌药物可用于包括肺癌、食道癌、子宫颈癌、毛细血管瘤等多种肿瘤的治疗。前期研究中证明了生物碱为白英抗肿瘤的活性成分，现从白英干燥全草中提取总生物碱，并通过传统柱色谱及液质联用色谱分离得到四种糖苷生物碱单体，考察白英总碱的急性毒性及对三种非小细胞肺癌的抑制作用。最后，基于血管新生探讨白英生物碱通过凝集脂筏胆固醇抑制血管新生的抗肿瘤作用机制。
　　主要研究内容如下:
　　1.首先以70％乙醇回流提取白英干燥全草，并经过D151离子交换大孔吸附树脂富集，AB-8大孔树脂脱盐，得到白英总碱（记为STA）。然后借助柱色谱以乙酸乙酯-95％乙醇(2.5∶1)为洗脱剂初步分离所提取出的白英总碱，得到A、B两部分。再以液质联用色谱纯化，从A部分分离得到SA1和SA2，B部分分离得到SA3和SA4。借助核磁共振技术（包括一维1H-NMR和13C-NMR，以及二维1H-1H COSY、HMQC、HMBC、TOCSY和NOESY），分析鉴定四个化合物的结构，分别为:(3β，22α，25R)-spirosolan-5-en-3-yl O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranoside(SA1)、(3β，5α,22α,25R)-spirosolan-3-yl O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranoside(SA2)、(3β，22α,25R)-spirosol-5-en-3-yl O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-O-[β-D-xylopyranosyl-(1→3)]-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranoside(SA3)、(3β,5α,22α,25R)-spirosolan-3-yl O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-O-[β-D-xylopyranosyl-(1→3)]-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranoside(SA4),四个化合物均为以螺旋甾碱烷为苷元母核的甾体糖苷生物碱。经Science Finder检索结果表明，其中SA1、SA2、SA3为新化合物。以白英生物碱SA2作为对照品，采用酸性染料比色法进行总碱含量测定，经过方法学考察选出精密度、稳定性、重现性等均良好，且回收率高的总碱含量测定方法，经该方法检测三批白英总碱样品的总碱含量均在90％以上。
　　2.以小鼠急性毒性实验考察白英总碱的口服毒性作用;Lewis肺癌移植瘤小鼠模型研究白英总碱对其生存期的影响;以三种不同细胞亚型的非小细胞肺癌构建裸鼠异种移植瘤模型考察白英总碱的体内抗肿瘤效果;并对A549移植瘤裸鼠的瘤组织进行苏木精-伊红(HE)染色观察其病理学变化，以CD31标记的免疫组化法观察瘤组织内微血管密度(MVD)，免疫组化实验检测瘤组织周期蛋白CyclinA和CyclinB1表达水平，最后以TUNEL法检测移植瘤的细胞凋亡情况。小鼠急性毒性实验结果发现白英总碱给药剂量在10000 mg/kg.BW时未见动物死亡，最大耐受量实验中动物未见异常，以该剂量为白英总碱的口服安全剂量，因安全剂量范围大，可在某种程度上认为白英总碱基本无毒性作用。Lewis肺癌移植瘤小鼠的生存期实验结果提示白英总碱可以有效地延长生存时间(与模型组比,P＜0.05)，特别是白英总碱高剂量组的生命延长率与阳性对照紫杉醇组相当(P＞0.05)，而最先死亡的动物存活天数较紫杉醇组更长。裸鼠异种移植瘤抑制率实验结果表明白英总碱对三种不同细胞亚型人非小细胞肺癌的裸鼠异种移植瘤均呈现剂量依赖性的抑制作用，肿瘤体积和重量均有明显减少，并且体重均呈现逐步增加的趋势，而阳性对照紫杉醇组的动物体重增长相比较缓慢，展现了白英总碱抑瘤的同时毒副作用小的优势。HE染色A549移植瘤组织病理学检查结果显示，肉眼观察，与模型组相比，给药组细胞生长活跃性降低，组织坏死面积扩大，特别是白英总碱高剂量组可见明显坏死;血管依白英总碱给药剂量增加而减少，高剂量组几乎观察不到血管;纤维组织增生情况在给药后也有明显减弱。以CD31染色瘤组织进行免疫组化实验观察肿瘤微血管密度MVD发现，与空白对照组相比，随着白英总碱浓度的增加，肿瘤组织总血管数逐渐减少。免疫组化结果显示白英总碱的抑制作用也体现在CyclinA和CyclinB1的蛋白表达(与模型组比，P＜0.05)，表明白英总碱对非小细胞肺癌紊乱的细胞周期的调控作用，最后白英总碱升高肿瘤细胞凋亡指数亦再一次验证白英总碱对非小细胞肺癌的抑制作用。
　　3.通过Transwell小室同时培养HUVECs与A549细胞构建共培养体系制备肿瘤血管内皮细胞Td-ECs。以RT-PCR检测Td-ECs中肿瘤血管内皮细胞特异性抗原TEM1和TEM8的表达情况;以透射电镜和扫描电镜观察Td-ECs超微结构;采用MTT法检测Td-ECs增殖能力;细胞划痕愈合实验和Transwell小室迁移实验观察Td-ECs迁移能力;Transwell小室侵袭实验观察Td-ECs侵袭能力;以体外管腔形成、大鼠动脉环出芽、鸡胚尿囊膜及斑马鱼肠下血管新生等实验从细胞、组织、整体水平多个角度考察白英生物碱的抗血管生成作用。结果显示，通过Transwell小室成功构建了共培养体系，上室A549细胞与下室HUVECs之间的聚碳酸醋膜，使得肿瘤细胞分泌相关因子诱导HUVECs发展为肿瘤血管内皮细胞Td-ECs;经RT-PCR检测可扩展出肿瘤血管内皮细胞特有表达抗原TEM1和TEM8的条带。经共培养所得到的Td-ECs与HUVECs相比，超微结构发生了一系列的变化。透射电镜下主要表现为线粒体形态的改变，Td-ECs细胞内出现较多的囊泡结构，线粒体空泡化明显;扫描电镜下Td-ECs细胞伸展度减小，可观察到细胞末端丝状伪足变少，变短，这些改变使得Td-ECs更易于增殖、迁移。白英生物碱可剂量依赖性地抑制Td-ECs增殖，其中SA1的抑制作用最弱，在剂量100μM内未能达到半抑制浓度(IC50); SA2、SA3、SA4、STA的半抑制浓度分别为81.334μM、75.265μM、2.950μM、49.548μg/mL。从四种糖苷生物碱的IC50及各自结构式看出，糖链部分的不同和甾体母核5/6位的饱和程度可能影响糖苷生物碱对细胞增殖的抑制作用。划痕愈合和Transwell小室实验从横向和纵向证明白英生物碱可以抑制Td-ECs的迁移及侵袭能力;还可抑制Td-ECs管腔样结构的形成;此外，白英生物碱SA2剂量依赖性以及时间依赖性的抑制大鼠动脉环切口处微血管样结构的芽生，浓度依赖性的抑制鸡胚尿囊膜及斑马鱼胚胎肠下的血管生成。
　　4.通过试管法检验白英生物碱SA2与胆固醇体外结合情况;以细胞外液LDH活性及PI染色判定Td-ECs细胞膜完整性和通透性;借助胆固醇试剂盒检测Td-ECs细胞内外胆固醇含量，并且提取脂筏检测脂筏区胆固醇含量，以荧光免疫双标记观察胆固醇与脂筏共定位情况，同时以Westernblot法检测ABCA1、ABCG1、AIBP蛋白表达水平考察胆固醇流出;借助透射电镜观察细胞膜小窝结构及数量;ELISA法检测Td-ECs细胞外液VEGF含量;Western blot法检测VEGFR2、AKT、SRC、FAK、ERK磷酸化水平;荧光免疫双标记法观察VEGFR2/CAV1及VEGFR2/EEA1共定位考察VEGFR2的内吞情况;最后以A549移植瘤斑马鱼评价白英生物碱SA2的抑瘤作用。结果显示，白英生物碱SA2可直接与胆固醇结合，破坏细胞膜的完整性，通透性增加，导致细胞内LDH外漏。SA2作用Td-ECs后，细胞内外胆固醇含量并未呈现良好的剂量和时间依赖性。经低中剂量SA2处理，细胞总胆固醇含量先降低随后升高，而在中高剂量SA2作用下，细胞总胆固醇水平又会从升高转为降低趋势，逐渐降至与对照组无显著差异(与对照组比，P＞0.05);细胞游离胆固醇水平整体呈现先下降后上升的趋势，培养基游离胆固醇水平则呈现下降的趋势;胆固醇流出相关蛋白ABCA1、ABCG1、AIBP表达量呈现剂量依赖性降低;40μM的SA2的作用下，脂筏区的胆固醇含量显著升高;经过荧光免疫双标记显示胆固醇与脂筏存在共定位，指示胆固醇的荧光强弱与试剂盒检测细胞内胆固醇含量结果基本一致。以上结果考虑SA2凝集脂筏胆固醇，激发细胞自身胆固醇反馈调节，诱导细胞内胆固醇的合成，致使细胞内胆固醇集聚，然而由于糖苷生物碱的束缚，胆固醇被包裹在细胞内难以流出，随着SA2浓度和作用时间的增加，最终导致细胞膜破碎。透射电镜观察发现SA2作用后细胞膜小窝数量明显减少，视野中很难找到小窝结构。SA2剂量依赖性的抑制肿瘤细胞分泌VEGF，同样剂量依赖性的阻碍VEGFR2、AKT、SRC、FAK、ERK的磷酸化水平。荧光免疫双标记结果显示，VEGFR2与CAV1、VEGFR2与EEA1均存在共定位，随着SA2的加入，Pearson相关系数降低，一定程度上阻碍VEGFR2的内吞，并且增加抑瘤基因CAV1的蛋白表达。最后人肺癌(A549)斑马鱼移植瘤实验显示SA2显著的体内抗肿瘤效果。
　　综上所述，本研究借助柱色谱和液质联用色谱从白英中提取分离得到四种以螺旋甾碱烷为苷元母核的糖苷生物碱。以三种不同细胞亚型的非小细胞肺癌构建裸鼠异种移植瘤模型证明了白英总碱的体内抗肿瘤效果。从肿瘤血管内皮Td-ECs增殖/迁移/侵袭及新生管腔、大鼠动脉环的出芽、鸡胚尿囊膜和斑马鱼的血管生成等多个角度展现白英生物碱抑制血管新生的作用。证明了白英生物碱SA2可与胆固醇直接结合，并且凝集脂筏胆固醇激发细胞自身的胆固醇反馈调节，随着SA2浓度和作用时间的增加，最终导致细胞膜破碎。SA2破坏细胞膜小窝结构，抑制VEGF/VEGFR2上下游血管新生相关通路的正常运转。提示“白英生物碱凝集腊筏胆固醇抑制血管新生的抗肿瘤机制”假说得到初步证明，但还需体内实验的验证，以及包括胆固醇反馈调节等更全面的实验数据支持，以期为假说提供更直接的依据。

目录

声明

摘要

英文缩略语

第一章 文献综述

1 非小细胞肺癌研究概况

2 肿瘤血管新生研究进展

2．1 血管新生的概念

2．2 肿瘤血管生成过程

2．3 VEGF／VEGFR2介导的肿瘤血管新生分子机制

3 胆固醇与抑制肿瘤血管新生潜在相关性

4 糖苷生物碱的研究进展

4．1 糖苷生物碱概述

4．2 糖苷生物碱药理作用及作用机制

5 中药白英的研究进展

5．1 本草考证

5．2 化学成分研究进展

5．3 药理作用研究进展

5．4 临床应用

6 研究目的及意义

第二章 白英生物碱的提取分离

1 材料

1．1 药材及主要试剂

1．2 主要试剂的配制

1．3 主要仪器

2 方法及结果

2．1 白英总碱的提取

2．2 白英生物碱单体的分离及结构解析

2．3 白英总碱的含量测定

3 讨论

第三章 白英总碱对非小细胞肺癌移植瘤裸鼠的抑制作用

1 材料

1．1 动物及细胞株

1．2 主要药物及试剂

1．3 主要药物及试剂的配制

1．4 主要仪器

2 方法

2．1 急性毒性实验

2．2 细胞培养

2．3 Lewis移植瘤小鼠生存期实验

2．4 人非小细胞肺癌裸鼠异种移植瘤抑制率实验

2．5 HE染色法A549移植瘤组织病理学检查

2．6 免疫组织化学法检测A549移植瘤组织中蛋白表达

2．7 Tuncl法检测A549移植瘤组织细胞凋亡

2．8 数据处理

3 结果

3．1 白英总碱的急性毒性实验

3．2 白英总碱对Lewis肺癌移植瘤小鼠生存期的影响

3．3 白英总碱对三种人非小细胞肺癌的裸鼠异种移植瘤的抑制作用

3．4 HE染色法观察肿瘤组织病理学变化

3．5 白英总碱对A549移植瘤裸鼠瘤组织微血管密度的影响

3．6 白英总碱对A549移植瘤裸鼠瘤组织中周期蛋白CyclinA和CyclinB1表达水平的影响

3．7 白英总碱对A549移植瘤裸鼠瘤组织中细胞凋亡的影响

4 讨论

第四章 白英生物碱对血管新生的抑制作用

1 材料

1．1 动物及细胞株

1．2 主要药物及试剂

1．3 主要药物及试剂的配制

1．4 主要仪器

2 方法

2．1 HUVECs与A549细胞共培养模型的制备

2．2 RT-PCR法检测Td-ECs中TEM1、TEM8基因表达

2．3 Td-ECs超微结构观察

2．4 MTT法检测细胞增殖

2．5 划痕愈合实验

2．6 Transwell小室迁移实验

2．7 Transwell小室侵袭实验

2．8 体外管腔形成实验

2．9 大鼠动脉环出芽实验

2．10 鸡胚尿囊膜实验

2．11 斑马鱼血管新生实验

2．12 数据处理

3 结果

3．1 共培养体系的建立

3．2 不同共培养时间Td-ECs中TEM1和TEM8的基因表达水平

3．3 Td-ECs超微结构观察

3．4 白英生物碱对Td-ECs增殖的影响

3．5 白英生物碱对Td-ECs迁移能力的影响

3．6 白英生物碱对Td-ECs侵袭能力的影响

3．8 白英生物碱对大鼠动脉环出芽的影响

3．9 白英生物碱对鸡胚尿囊膜血管生成的影响

3．10 白英生物碱对斑马鱼肠下血管生成的影响

4 讨论

第五章 白英生物碱凝集脂筏胆固醇抑制血管新生作用机理研究

1 材料

1．1 动物及细胞株

1．2 主要药物及试剂

1．3 主要仪器

2 方法

2．1 白英生物碱SA2与胆固醇体外结合实验

2．4 Td-ECs细胞内外胆固醇含量检测

2．5 Western blot法检测ABCA1、ABCG1、AIBP蛋白表达水平

2．6 Td-ECs细胞膜中脂筏提取

2．7 脂筏胆固醇含量检测

2．8 荧光免疫双标记法观察活细胞胆固醇定位

2．9 透射电镜观察小窝数量及形态

2．10 ELISA法检测Td-ECs细胞外液VEGF表达

2．11 Western blot法检测VEGFR2、AKT、SRC、FAK、ERK磷酸化水平

2．12 荧光免疫双标记法观察VEGFR2／CAV1及VEGFR2／EEA1共定位

2．13 斑马鱼评价白英生物碱SA2的抑瘤作用

2．14 数据处理

3 结果

3．1 白英生物碱SA2与胆固醇的体外结合

3．2 白英生物碱SA2对Td-ECs细胞膜完整性和通透性的影响

3．3 白英生物碱SA2对细胞内外胆固醇含量的影响

3．4 白英生物碱SA2对胆固醇流出相关蛋白的影响

3．5 白英生物碱SA2对细胞膜脂筏区胆固醇含量的影响

3．6 白英生物碱SA2对小窝的影响

3．7 白英生物碱SA2对肿瘤细胞分泌VEGF的影响

3．8 白英生物碱SA2对Td-ECs中VEGFR2、AKT、SRC、FAK、ERK磷酸化的影响

3．9 白英生物碱SA2对VEGFR2内吞的影响

3．10 白英生物碱SA2对人肺癌斑马鱼移植瘤的抑制作用

4 讨论

第六章 总结与展望

1 总结

2 展望

参考文献

致谢

个人简历

附录

附图