不同剂型附子理中丸化学成分与入血成分对比研究

摘要

本研究从多成分角度，采用液相色谱-质谱技术结合统计分析方法，比较不同剂型附子理中丸活性成分含量;采用药代动力学方法，探讨辅料炼蜜用量对活性成分吸收的影响;采用正常和脾阳虚模型动物，研究附子理中丸大蜜丸中活性成分在正常生理和病理状态下的药代动力学特征，从体内外探讨同方不同剂型药效物质基础的差异，为完善附子理中丸质量评价方法和临床用药提供科学依据。
　　在文献研究基础上，本文从下述方面进行了实验研究。
　　1.制备工艺对附子理中丸大蜜丸、浓缩丸和片剂主要成分含量的影响
　　附子理中丸大蜜丸、浓缩丸和片剂，除制附子外，其余4味中药提取工艺不同，成型工艺也存在差异。为确定制备工艺对不同剂型活性成分的影响，选取同一批次原料饮片，制备3种剂型的成品。采用RRLC-TQ-MS/MS方法，经方法学考察，建立了同时测定处方中16个活性成分含量的方法。因制附子均为原粉入药，因此3种剂型中制附子6个生物碱含量无显著差异(P＞0.05);由于大蜜丸各药味均为原粉入药，而浓缩丸和片剂经过提取、浓缩等热处理过程，因此干姜、党参、炒白术和炙甘草中的9个成分（除异甘草素在大蜜丸与浓缩丸之间无显著差异，P＞0.05），在大蜜丸中的含量均显著高于浓缩丸和片剂（P＜0.01）;浓缩丸和片剂比较，干姜和白术均采用渗漉，但乙醇浓度不同，后续成型工艺也存在差异，引起对应的成分6-姜辣素和3个白术内酯成分具有显著差异(P＜0.01);党参在浓缩丸中采用乙醇提取，而在片剂中采用水提取，显示腺苷含量在浓缩丸中显著高于片剂（P＜0.01）;甘草在浓缩丸中部分采用乙醇提取、部分原粉入药，而在片剂中采用水提取，显示浓缩丸中甘草黄酮成分竹草素、异甘草素和甘草苷的含量都显著高于片剂（P＜0.01）。显示测定的16个活性成分中有9个含量存在显著差异。
　　结果提示，不同提取溶剂和乙醇浓度等制备工艺不同，能引起3种剂型成品中活性成分含量显著差异。同时，遇光遇热不稳定的成分，在制备工艺复杂的浓缩丸和片剂中，容易受到影响而显著降低。
　　2.不同厂家生产的附子理中丸大蜜丸与浓缩丸主要活性成分含量对比研究
　　复方整体成分组成还受到原料差异的影响，为从整体上比较附子理中丸传统剂型与现代剂型活性成分含量的差异，选取11个厂家生产的共49个批次成品作为研究对象，包括大蜜丸27个批次、浓缩丸22个批次，将原料饮片质量可能存在的差异纳入考虑范畴，测定16个活性成分含量，并采用PCA和OPLS方法对结果进行分析，以科学评价两种剂型成分含量的异同。
　　结果显示，有14个批次成品原料制附子中3种双酯型生物碱的总含量超过0.01％，5个批次3种单酯型生物碱的总含量低于0.01％，均不符合药典规定;大蜜丸与浓缩丸成分差异显著，差异主要来源于干姜中的6-姜辣素、自术中的白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ，大蜜丸成分含量显著高于浓缩丸;同一剂型不同厂家成品含量差异大于同一厂家的;大蜜丸不同厂家成分含量差异，主要源于制附子中的6个生物碱成分乌头碱、新乌头碱、次乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱;浓缩丸不同厂家差异，源于干姜中的6-姜辣素、党参中的腺苷、以及制附子中的苯甲酰乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱。
　　结果提示，附子理中丸大蜜丸与浓缩丸主要活性成分含量显著差异成分为对光和热不稳定的成分，与制备工艺有关。在复方的质量控制中，需要更加注意这些不稳定的成分。同时，需要加强中成药原料质量，尤其是有毒中药制附子的质量控制。
　　3.附子理中丸大蜜丸和水蜜丸药代动力学特征对比研究——炼蜜量的影响
　　附子理中丸大蜜丸和水蜜丸两种剂型唯一的区别在于辅料炼蜜的用量不同，大蜜丸的炼蜜用量为水蜜丸的两倍。为了探究辅料炼蜜对附子理中丸活性成分药代动力学的影响，选择SD大鼠，分别给予含蜜量不同的附子理中丸大蜜丸和水蜜丸，于给药后不同时间点取血，采用RRLC-TQ-MS/MS方法，经方法学考察，建立了同时测定其中21个活性成分血药浓度的方法，测定不同时间点血药浓度，绘制血药浓度-时间曲线，计算药代动力学参数。
　　结果显示具有显著差异的药动学参数包括，制附子双酯型生物碱乌头碱、新乌头碱和次乌头碱的药-时曲线下面积(AUC)、药峰浓度(Cmax)、达峰时间（Tmax）和半衰期(t1/2)均为大蜜丸＞水蜜丸，而清除率(CL)为大蜜丸＜水蜜丸;单酯型生物碱中苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱的AUC(0-t)、Tmax和t1/2均为大蜜丸＜水蜜丸，而Cmax和CL为大蜜丸＞水蜜丸，两种剂型均未检测到苯甲酰乌头原碱;醇胺型生物碱乌头原碱、新乌头原碱和次乌头原碱的AUC(0-t)、Tmax和t1/2均为大蜜丸＜水蜜丸，而Cmax和CL为大蜜丸＞水蜜丸;干姜中6-姜辣素在两种剂型中均未被检测到;党参中腺苷和党参炔苷在大蜜丸中均检测到，而在水蜜丸中均未检测到;甘草中甘草苷、异甘草苷、甘草素和甘草酸的AUC(0-t)和Cmax均为大蜜丸＞水蜜丸，异甘草苷、甘草素、异甘草素和甘草酸的t1/2为大蜜丸＞水蜜丸，异甘草苷和甘草酸的Tmax为大蜜丸＞水蜜丸，异甘草苷、甘草素、异甘草素和甘草酸的CL为大蜜丸＜水蜜丸;白术中白术内酯Ⅲ的AUC(0-t)、Cmax均为大蜜丸＞水蜜丸，而CL为大蜜丸＜水蜜丸，白术内酯Ⅰ和白术内酯Ⅱ的AUC(0-t)、Cmax均为大蜜丸＜水蜜丸，而CL为大蜜丸＞水蜜丸。即与水蜜丸比较，大蜜丸中制附子3种双酯型生物碱、甘草4种黄酮和甘草酸、以及白术中白术内酯Ⅲ或达峰时间延长，或消除缓慢。辅料炼蜜具有缓和药物某些成分吸收的作用。
　　4.附子理中丸大蜜丸在正常和模型动物的药代动力学特征对比研究
　　药物主要应用于病理状态下，不同机体状态对药物活性成分药代动力学特征可能产生影响。因此采用已建立的RRLC-TQ-MS/MS方法，比较了附子理中丸大蜜丸在正常和脾阳虚模型大鼠单次给药、以及模型动物单次和多次给药21个活性成分体内吸收情况。正常动物与模型动物单次给药结果显示，具有显著差异的药动学参数包括：制附子3种双酯型生物碱的AUC(0-t)和Cmax均为模型组＞正常组，而CL为模型组＜正常组，次乌头碱的t1/2为模型组＞正常组;单酯型生物碱中苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱的AUC(0-t)、Cmax和t1/2均为模型组＞正常组，而Tmax和CL为模型组＜正常组，正常组未检测到苯甲酰乌头原碱，而在模型组中检测到;醇胺型生物碱中乌头原碱和次乌头原碱AUC(0-t)均为模型组＜正常组，新乌头原碱和次乌头原碱Cmax均为模型组＜正常组，而乌头原碱的CL为模型组＞正常组;干姜中6-姜辣素在两种动物中均未被检测到;党参中腺苷和党参炔苷在正常组中均检测到，而在模型组中均未检测到;甘草中甘草苷和异甘草苷的AUC(0-t)、Cmax和t1/2均为模型组＞正常组，而CL为模型组＜正常组，甘草素和异甘草素的AUC(0-t)和t1/2均为模型组＜正常组，而CL为模型组＞正常组，甘草酸和甘草次酸的AUC(0-t)和Cmax均为模型组＞正常组，而甘草次酸的CL为模型组＜正常组;白术中自术内酯Ⅰ的AUC(0-t)、Cmax和t1/2均为模型组＜正常组，白术内酯Ⅲ的AUC(0-t)、和Cmax均为模型组＜正常组，白术内酯Ⅱ在正常组中检测到，而在模型组中未检测到。提示与正常动物比较，模型动物乌头碱、新乌头碱、次乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、甘草苷、异甘草苷、甘草酸及甘草次酸9个成分入血增多，消除减慢。表明脾阳虚病理状态促进了附子理中丸大蜜丸活性成分的吸收入血，代谢和消除减慢，作用时间延长，从而更好地发挥治疗作用。模型动物单次和多次给药药动学结果显示，具有显著差异的药动学参数包括：制附子中3种双酯型生物碱的AUC(0-t)和Cmax均为单次给药组＞多次给药组，而乌头碱和新乌头碱的CL为单次给药组＜多次给药组;3种单酯型生物碱的AUC(0-t)为单次给药组＜多次给药组，苯甲酰乌头原碱和苯甲酰新乌头原碱的Cmax为单次给药组＜多次给药组，苯甲酰新乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱的t1/2为单次给药组＜多次给药组，而3种单酯型生物碱的CL为单次给药组＞多次给药组;醇胺型生物碱中乌头原碱和新乌头原碱的AUC(0-t)、和t1/2均为单次给药组＜多次给药组，而CL为单次给药组＞多次给药组，新乌头原碱的Cmax为单次给药组＜多次给药组;甘草中异甘草苷的AUC(0-t)、t1/2和Cmax均为单次给药组＞多次给药组，而CL单次给药组＜多次给药组;白术中白术内酯Ⅲ的AUC(0-t)和Cmax均为单次给药组＞多次给药组，而Tmax和CL为单次给药组＜多次给药组，白术内酯Ⅰ的AUC(0-t)和Cmax均为单次给药组＜多次给药组，而Tmax和CL单次给药组＞多次给药组，白术内酯Ⅱ在多次给药组中检测到，而在单次给药组中未检测到。即与模型动物单次给药比较，模型动物多次给药后附子理中丸大蜜丸毒性最大的3种双酯型生物碱、甘草中异甘草苷以及白术中白术内酯Ⅲ入血减少且消除加快，并接近于正常动物单次给药的药动学参数。提示病理状态下随着给药次数增加，活性成分体内吸收发生改变。
　　结论表明不同剂型的附子理中丸中对光和热不稳定的成分含量存在显著差异。传统剂型中的辅料炼蜜能够起到延缓成分吸收的作用。病理状态能够促进附子理中丸活性成分吸收，从而更好地发挥治疗作用。此外，应加强中成药原料尤其是有毒中药制附子的质量控制。

目录

声明

摘要

缩略词中英文对照表

1附子理中丸方源、方解研究

2附子理中丸制剂工艺研究

3附子理中丸质量标准研究

3．1显微鉴别和薄层色谱鉴别

3．2指纹图谱分析

3．3检查

3．4含量测定

4附子理中丸药代动力学研究

5附子理中丸药理学研究

5．1对神经系统的影响

5．2抗炎、镇痛作用

5．3对消化系统的影响

5．4增强机体免疫功能

6附子理中丸临床研究

6．1腹泻、慢性肠炎

6．2胃炎、胃下垂

6．3其它

7附子理中丸毒副作用研究

前言

第一章制备工艺对附子理中丸大蜜丸、浓缩丸和片剂主要成分含量的影响

1仪器与材料

2方法与结果

2．1色谱条件与质谱条件

2．2不同剂型附子理中丸的制备

2．3对照品溶液的制备

2．4供试品溶液的制备

2．5标准曲线的制备与检测限、定量限

2．6精密度考察

2．7重复性试验

2．8稳定性试验

2．9回收率试验

2．10含量测定及16种成分含量对比

3讨论与小结

第二章不同厂家生产的附子理中丸大蜜丸与浓缩丸主要活性成分含量对比研究

1仪器与材料

2方法与结果

2．1色谱条件与质谱条件

2．2对照品溶液的制备

2．3供试品溶液的制备

2．4方法学考察

2．5含量测定

3讨论与小结

3．1附子理中丸大蜜丸与浓缩丸对比

3．2不同厂家同一剂型含量对比

3．3药典中有含量限度的原料质量分析

第三章附子理中丸大蜜丸与水蜜丸药代动力学特征对比研究——拣蜜量的影响

1仪器与材料

2方法与结果

2．1色谱条件与质谱条件

2．2附子理中丸大蜜丸与水蜜丸的制备及药物配制

2．3对照品溶液的制备

2．4动物分组与给药方案

2．5血样采集与血浆处理方法

2．7 RRLC-TQ-MS／MS方法学考察

2．8药代动力学参数

3讨论与小结

3．1制附子中生物碱成分药代动力学分析

3．2干姜和党参中活性成分药代动力学分析

3．3甘草中活性成分药代动力学分析

3．4自术中活性成分药代动力学分析

3．5样品处理方法及检测条件的分析

3．6小结

第四章附子理中丸大蜜丸在正常和模型动物的药代动力学特征对比研究

1仪器与材料

2方法与结果

2．3动物分组

2．4脾阳虚造模方法及给药方案

2．5指标观察及测定

2．6血样采集与血浆样品处理

2．7药代动力学参数

3讨论与小结

3．1正常与模型动物单次给药的药代动力学分析

3．2模型动物单次与多次给药的药代动力学对比分析

3．3小结

参考文献

研究总结

致谢

个人简历