党参成分对大鼠脑微血管内皮细胞缺氧/缺糖损伤的保护作用与机制

摘要

实验目的: 脑是人体对缺氧最为敏感的器官，脑组织缺血，将会导致局部脑组织及其功能的损害。微血管内皮细胞是脑缺血性损害的重要靶点之一。微血管内皮细胞是血脑屏障重要组成部分，缺血后的脑微血管内皮细胞损伤直接导致血脑屏障破坏，引起脑血管通透性增高和血管源性脑水肿，并最终导致脑神经细胞损伤。近年来，有学者提出了“神经血管单元”的概念。“神经血管单元”由神经细胞、内皮细胞、星形胶质细胞三类主要细胞及位于它们周围的维持大脑组织完整性的细胞外基质组成，在脑缺血后应作为一个整体来综合考虑。既往缺血性脑血管病的研究一直主要集中于神经细胞，而对内皮细胞的关注不够。研究发现仅仅激活内源性神经再生的效果并不满意，如果更加重视对内皮细胞的保护，可能取得更好的临床疗效。所以，研究缺血后脑血管内皮细胞的损伤机制并寻找出行之有效的减轻损害的方法，对于缺血性脑血管病的预防及治疗有重要的意义。 中风病为现代医学重大疾病之一，现代医学治疗尚不理想。由于对缺血性中风病急性期起关键作用的病理因素和病理环节认识不同，中医治疗多强调祛痰、调化瘀、痰瘀同治、调通腑、清热解毒；多以祛邪为主要治则，忽略了对人体正气的顾护。为此，本课题组提出了中风病急性期的“扶正护脑”治则，主张在祛邪护脑治疗的同时及早采用扶正固本法则，顾护人体正气，拓宽了缺血性中风病急性期的中医治疗思路。在中风病急性期采用“扶正护脑”治则及其治法方药，符合仲景“未虚先防，已虚防变”的治疗思想。 中药党参，为扶正固本、益气类的临床常用代表药。既往临床和实验研究证实了桔梗科党参及其成分有较好的脑保护作用，本实验室以往研究证明党参3种成分：党参总皂苷、党参皂苷L-1、党参SFE提取物对大鼠脑神经元、星形胶质细胞缺氧/缺糖损伤具有显著保护作用。本课题采用大鼠脑微血管内皮细胞缺氧/缺糖模型模拟缺血损伤，以LDH、NO、SOD、MDA、细胞坏死率、凋亡率、凋亡蛋白酶活化等指标评价确定党参3种成分：党参总皂苷、党参皂苷L-1、党参SFE提取物对脑微血管内皮细胞缺氧/缺糖损伤的影响，探讨3种党参成分对脑微血管内皮细胞缺氧/缺糖损伤的保护作用，并初步探索了其作用机制，为中风病急性期“扶正护脑”治则和中药党参成分用于中风病急性期临床治疗提供初步实验依据，为中医药治疗中风病急性期开辟了一个新的思路。 实验方法: 1.原代分离、纯化、培养大鼠脑微血管内皮细胞，并采用形态学、免疫细胞化学(Ⅷ因子相关抗原阳性)技术鉴定细胞。 2.通过形态学观察和MTT实验，检测不同终浓度的党参总皂苷、党参皂苷L-1、党参成分SFE提取物，分别在正常培养状态下对大鼠脑微血管内皮细胞活性的影响，并确定各药物的最佳浓度。 3.采用化学方法检测缺氧/缺糖损伤细胞上清液LDH漏出率(常规生化学方法)、N0(硝酸还原酶法)和MDA的含量(硫代巴比妥酸法)以及SOD的活力(黄嘌呤氧化酶法)。 4.采用Hoechst 33342和PI双染法荧光显微镜检测缺氧/缺糖损伤后不同终浓度的不同党参成分对细胞的凋亡率和坏死率的影响。 5.采用免疫细胞化学方法和图象半定量分析技术测定缺氧/缺糖损伤后不同终浓度的不同党参成分对大鼠脑微血管内皮细胞Caspase-3表达的平均光密度。 6.实验结果采用SPSS40.0进行数据统计和方差分析。 结论: 大鼠脑微血管内皮细胞缺氧/缺糖模型能很好的模拟脑缺血损伤。缺氧/缺糖损伤能显著提高细胞上清液LDH的漏出率、NO和MDA含量，同时能显著降低SOD的活力；能够显著增加细胞的死亡率、凋亡率及凋亡蛋白酶Caspase-3的活性。而中药党参的有效成分可以阻断上述损伤机制，保护脑微血管内皮细胞，减轻脑组织缺血/缺氧性的损伤。实验结果说明：①党参总皂苷中、低终浓度组，党参皂苷L-1低终浓度组，党参成分SFE提取物低终浓度组有显著疗效，与模型组比较；②党参皂苷L-1中终浓度组，党参成分SFE提取物中终浓度组也有疗效，但不如上述组，与模型组比较；③党参总皂苷高终浓度组，党参皂苷L-1高终浓度组无保护作用，与模型组比较;④并且党参成分SFE提取物高终浓度组可能还会加重缺氧/缺糖对大鼠脑微血管内皮细胞的损伤，与模型组比较。

目录

论文说明：英文缩略词表

前言

第一部分综述

综述一 脑微血管内皮细胞的特点及其与脑缺血损伤的关系

综述二 缺血性脑血管病的病理机制及中药的脑保护作用

第二部分实验研究

实验一 3种党参不同成分对大鼠脑微血管内皮细胞的细胞毒性实验

材料与方法

结果

讨论

参考文献

实验二 脑微血管内皮细胞缺氧/缺糖损伤模型的制备

材料与方法

结果

讨论

参考文献

实验三 不同终浓度的3种党参成分对缺氧/缺糖时脑微血管内皮细胞活性的影响

材料与方法

结果

讨论

参考文献

实验四3种党参成分对脑微血管内皮细胞缺氧/缺糖损伤时细胞坏死率和凋亡率的影响

材料与方法

结果

讨论

参考文献

实验五3种党参成分对脑微血管内皮细胞缺氧/缺糖损伤时乳酸脱氢酶漏出率的影响

材料与方法

结果

讨论

参考文献

实验六 3种党参成分对脑微血管内皮细胞缺氧/缺糖损伤时NO含量的影响

材料与方法

结果

讨论

参考文献

实验七 3种党参成分对脑微血管内皮细胞缺氧/缺糖损伤时SOD活性和MDA含量的影响

材料与方法

结果

讨论

参考文献

实验八 3种党参成分对脑微血管内皮细胞缺氧/缺糖损伤时CASPASE-3表达的影响

材料与方法

结果

讨论

参考文献

致谢

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