近交系大鼠SNP遗传检测方法技术的建立研究及封闭群SD大鼠遗传多样性研究

摘要

近年来，随着分子生物学技术的快速发展，实验动物遗传检测方法不断改进和提高，从蛋白到基因组序列，从宏观到微观，以达到准确、快速、高通量的检测要求。目前，国内外对近交系小鼠SNP遗传检测的研究较多，而对大鼠 SNP遗传标记的研究较少，尤其是针对主要组织相容性复合体（RT1）上SNP遗传标记的研究尚未见报道。主要组织相容性复合体（RT1）是决定近交系大鼠免疫遗传品质最主要的基因群，也是进行遗传学检测的一个重要研究领域。本论文主要研究近交系大鼠遗传检测的分子生物学方法，以大鼠 RT1复合物基因组中具有多态性的单个核苷酸（SNP）为研究对象，利用分子生物学技术，建立了三种SNP遗传检测方法，为实验大鼠的遗传质量控制进一步完善我国实验动物提供新的遗传检测技术手段。
　　本研究分为三个方面。第一部分是建立近交系大鼠 SNP直接测序分型的遗传检测方法。通过比对NCBI Nucleiotide数据库，查询BN与F344近交系大鼠多态性程度高的区域即RT1区序列，选定多态性信息丰富的5个区域（A区、B区、C区、D区、E区），以国内7种近交系大鼠（BN、F344、WKY、LEW、SHR、MIJ和HFJ）为模板进行扩增，目的片段经直接测序后进行序列比对，结果显示共获得10个SNP多态性位点，即A区序列545位（A/G）；B区序列279位（T/C）、548位（A/C）；C区序列207位（C/T）、356位（T/C）、386位（C/T）；D区序列192位（A/G）；E区序列135位（C/T）、425位（A/G）、683位（A存在/缺失）。其中5个SNP位点已在NCBI SNP数据库中公布且获得RS号。此外，3个区域（B区、CD区、E区）的多态性信息丰富，每300bp包含1个SNP位点。不同品系大鼠在这5个区域上拥有不同的基因型，由此建立 SNP直接测序的遗传检测方法，能够对常用近交系大鼠和新培育品系进行遗传检测及鉴定研究。
　　第二部分是建立近交系大鼠SNP荧光定量PCR的遗传检测方法。在大鼠RT1区选择9个有效的SNP位点（RS13458024、RS13457316、RS13456231、RS8159611、RS8149053、RS8156941、RS8166089、RS8160925、RS13448591），并设计相应的Taqman MGB探针。制备每个SNP位点不同基因型的质粒对照品，以验证探针的特异性。验证结果显示表明，2个Taqman MGB探针（RS13457316、RS8156941）荧光扩增信号不强并无法准确判定SNP位点的基因型，检测效果较差，另外；7个探针能够准确判定对照品的基因型，特异性强。使用这7个探针检测能够鉴别国内常用大鼠品系（BN、F344、WKY、LEW、SHR）和新培育品系（MIJ、HFJ）的基因型，根据SNP位点基因型的差异鉴别不同品系的遗传背景，建立近交系大鼠 SNP荧光定量 PCR遗传检测方法。实验中对于鉴别LEW/WKY、MIJ/HFJ这种亲缘关系较近的品系，仍需要在研究中扩大检测的SNP位点数目进行区分。
　　第三部分是建立高保真酶特异性 SNP遗传检测方法。在单管双向等位基因特异性 PCR中引入高保真酶的校正机制和硫代磷酸化修饰引物的抗外切酶作用，建立高保真酶特异性SNP检测方法。在RT1区1717个SNP位点中选择多态性信息含量丰富的12个SNP为遗传检测位点（RS13458024、RS13457316、RS13456231、RS8159611、RS8149053、RS8156941、RS8166089、RS8160925、RS13448591、RS13451966、RS8158177、RS13458074），经实验优化后得到9个SNP位点的高保真酶检测体系。该体系能够对国内5种大鼠近交系（BN、F344、WKY、LEW、SHR）和2种新培育品系（MIJ和HFJ）进行基因型检测和品系间鉴定，其基因型结果均经测序验证，证实方法的特异性和可靠性。此外其次，使用该方法对国内培育的30只SD大鼠进行遗传检测。在9个SNP位点上，其中4个位点在SD群体中完全纯合，在RS13448591（A/G）、RS13458024（A/G）、RS13458074（T/C）、RS13457316（A/G）、RS13456231（T/C）这5个位点上出现杂合型，群体统计学分析结果显示，观察得到杂合子基因型频率观察值依次为0.1667，0.4333，0.4667，0.2667，0.1000，期望杂合度Nei（1973）依次为0.1528，0.4061，0.4444，0.2778，0.0950，遗传多样性Shannon指数（I）依次为0.2868，0.5961，0.6365，0.4506，0.1985，对这5个多态性位点的群体基因型进行X2检验，显示其P值均大于0.05，群体统计学分析结果显示该群体符合Hardy-Weinberg平衡，样本具有代表性。并使用Shannon指数（I）和期望杂合度（Nei’1973）写出数值对该SD大鼠封闭群内遗传多样性进行描述。
　　本研究中，以SNP为遗传标记，分别使用直接测序技术、荧光定量PCR技术及高保真酶特异性检测技术，建立三种不同的SNP基因型遗传标记的检测体系，并把这些方法应用于近交系大鼠常用品系和新培育品系的遗传检测中，。此外，还对封闭群大鼠的SNP位点的基因型进行研究，对其基因频率、基因型频率及杂合性进行了探讨。这些研究不仅为各近交大鼠品系间的鉴定提供了实验依据，而且还为近交系和封闭群大鼠的遗传检测提供了新方法技术。本研究对提高我国实验动物遗传检测技术水平，促进生命科学发展具有重要意义。

目录

封面

目录

中文摘要

英文摘要

前 言

第一部分 大鼠 SNP 直接测序分型遗传检测方法的建立

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 分析与讨论

5 小结

第二部分 大鼠 SNP 荧光定量 PCR 遗传检测方法的建立

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 分析与讨论

5 小结

第三部分 大鼠 SNP 高保真酶特异性遗传检测方法的建立

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 分析与讨论

4 小结

实验总结

参考文献

缩略语索引

文献综述

致谢

在读期间发表的文章

声明