GAGA样元件结合蛋白的筛选克隆及其对Hsp90基因调控作用的初探

摘要

热休克蛋白家族成员中的分子量为90kD的热休克蛋白(Hsp90)是真核细胞中最丰富的蛋白质之一.Hsp90能使在热休克等应激反应中积累的误折叠蛋白重新折叠,并可促进已变性的蛋白质降解.Hsp90还参与激素受体、某些转录因子、信号途径和翻译起始阶段的激酶及一氧化氮合酶的成熟、胞内转运和活性调节.因此Hsp90在真核细胞中有着广泛而重要的功能.利用含有GAGA元件核心序列的寡核苷酸片段作探针,与42℃热休克处理前后的Jurkat细胞核抽提物进行电泳迁移率变更分析(EMSA)检测,发现在热休克前后均出现特异结合带,而且在热休克后更明显,提示在人Jurkat细胞核抽提物中可能存在GAGA样元件的特异结合蛋白,并且在热休克时结合活性增加.为筛选人Jurkat细胞中GAGA样元件的结合蛋白,我们采用酵母单杂交体系对人Jurkat细胞MATCHMAKER cDNA文库进行了筛选,结果出现63个His<'+>阳性克隆.进一步进行β-半乳糖苷酶活性分析,发现其中9个克隆显示较强的β-半乳糖苷酶活性.为探讨GLBP1蛋白对hsp90基因的调控功能,我们首先通过对实验条件的优化,建立了定量检测应激基因启动子活性的竞争RT-PCR的体系.由于荧光素酶对热休克非常敏感,不适用于激(热休克)基因调控的研究.而氯霉素乙酰基转移酶(CAT)是一种非常稳定的蛋白,在60℃,10min的条件下仍保持酶活性,所以CAT基因更适用于研究热休克基因启动子活性.同时检测CAT活性的经典方法所得的结果不仅反映基因转录、mRNA的稳定性，也反映了翻译及翻译后水平的调控，所以我们建立了用RT-PCR直接检测CAT报告基因的转录本（mRNA)水平的体系.分别将编码GLBP1蛋白正义及反义cDNA真核表达质粒分别与人hsp90α或hs90β基因上游调控序列驱动的CAT报告基因共转染Jurkat细胞,利用竞争RT-PCR方法检测启动子活性.为了在体外重建染色质结构,我们应用昆虫表达体系表达并纯化了染色质组装因子ACF及NAP-1蛋白;并从小牛胸腺水牛胸腺组织中纯化了核心组蛋白,从而为进一步在染色质水平研究基因表达调控奠定基础.

目录

缩写词表

前 言

试剂与材料

第一部分：应用酵母单杂交体系在人Jurkat细胞cDNA文库中筛选GAGA样元件的结合蛋白

方法

结果

方法

结果

第三部分GAGA样结合蛋白功能的初探

方法

结果

第四部分：染色质组装因子的纯化

方法

结果

讨 论

小 结

参考文献

文献综述

致 谢