人清道夫受体AⅡ（SR-AⅡ）胞外部分在毕赤酵母的分泌表达及其拮抗剂筛选模型的构建研究

摘要

在现代社会各种疾病中,心血管疾病的发病率和死亡率均居前列,动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是其主要病理基础.巨噬细胞上清道夫受体A(Macrophage Scavenger Receptor A,SR-A,亦被称为MSR1)是动脉粥样硬化发生、发展过程的重要参与者,可无限制摄取修饰低密度脂蛋白(modified low densitylipoprotein,mLDL),其摄取不存在负反馈机制,形成泡沫细胞,最终出现动脉粥样硬化病灶.因此SR-A被认为是发现新型心血管药物的潜在靶位,抑制SR-A活性的化合物有望成为治疗动脉粥样硬化的候选药物.使用200 nM PMA诱导THP-1细胞4天,THP-1细胞分化为巨噬细胞,提取其总RNA.应用两步法RT-PCR扩增得到编码人Ⅱ型SR-A胞外部分(shSR-AⅡ)的cDNA片段,克隆至pGEM-T载体,测序结果表明DNA序列与文献报道一致.将此片段克隆至巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌表达载体pPIC9K中,构建重组表达质粒p9K-shSR-AⅡ.U937泡沫细胞模型进一步表明shSR-AⅡ可通过竞争性结合oxLDL阻止巨噬细胞摄取oxLDL,从而抑制泡沫细胞形成,为以shSR-AⅡ为靶点建立抗动脉粥样硬化药物筛选模型奠定了基础.同时初步研究了重组菌株在不同发酵条件下的分泌表达情况.以受体-配基竞争性结合的原理为基础,通过对各种条件的优化,包括采用硫酸铵分级沉淀方法,初步分离纯化shSR-AⅡ;配基oxLDL的包被液等,以重组shSR-AⅡ建立了SR-A拮抗剂筛选模型.应用模型对560个化合物、220个微生物发酵液及320个微生物发酵液丙酮提取物进行了初步筛选,初筛阳性率为1.0%.对初筛阳性化合物进行了进一步筛选,得到3个阳性化合物,具有浓度依赖抑制效应,U937泡沫细胞模型显示其中2个阳性化合物可明显抑制泡沫细胞形成.本研究首次利用巴斯德毕赤酵母分泌表达shSR-AⅡ;并以受体-配基竞争性结合为基础,利用重组shSR-AⅡ建立了拮抗剂高通量筛选模型,为国内外首次报道,为大规模筛选出活性拮抗剂奠定基础.

目录

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Abstract

前言

材料与方法

1.1材料与方法

1.2实验方法

结果与讨论

2.结果

2.1.shSR-A-Ⅱ的诱导表达

2.2.发酵条件对shSR-A-Ⅱ分泌表达的影响

2.3.高通量筛选shSR-A-Ⅱ拮抗剂筛选的建立与微生物发酵样品的初筛结果

3.讨论

结论

参考文献

文献综述多功能的巨噬细胞清道夫受体A研究进展

综述参考文献

附录

致谢