神经营养素受体TrkA、p75NTR与RanBPM及其它蛋白之间相互作用的研究

摘要

神经营养素能够影响脊椎动物神经元的增殖、分化、凋亡、存活等生命过程，但其功能的发挥则需要Trk和p75NTR两种膜受体的存在。TrkA受体是一种酪氨酸激酶受体，同其它酪氨酸激酶受体一样，其受体膜内区的酪氨酸被磷酸化后，可以被其它信号分子识别，为信号的传导提供有关蛋白的募集位点。肝细胞生长因子的受体Met也是一种酪氨酸激酶的受体，它的酪氨酸激酶区同TrkA相比具有37％的同源性，已有研究报道该受体能够与一种称为RanBPM的蛋白相互作用，并激活下游的Ras信号通路。基于上述考虑，加之在前期工作中我们曾发现p75NTR与RanBPM有结合作用，推测TrkA有可能与RanBPM间亦存在相互作用，进而有望解释Trk和p75NTR异源双体的形成和信号传导中的一些问题。为此，我们1、通过酵母双杂体系、GSTpull-down实验、免疫共沉淀和免疫杂交及荧光共振能量转移(FRET)方法证明了TrkA的膜内区能够与RanBPM相互作用。 2、通过酵母双杂实验及体内实验证明RanBPM的SPRY结构域参与了同TrkA之间的相互作用，并且利用酵母双杂体系证实是TrkA的酪氨酸激酶区负责与SPRY相互作用。 文献报道p75NTR和TrkA的膜内区不能相互结合，因此我们推测RanBPM可能是将两种受体连接起来形成异源双体的原因之一。通过研究证明：1、RanBPM能够募集TrkAICD及p75NTRICD，使三者以蛋白复合物的形式存在。 2、运用质谱的方法发现，在以上的免疫复合物中还有HSP70、HSP90，β-actin，eIF4A的存在，经酵母双杂验证TrkAICD及p75NTRICD都能够与eIF4A相互作用，并且TrkAICD能够与HSP70相互作用。 我们又通过实验对参与神经递质释放的蛋白snapin进行了研究，结果发现：在酵母体双杂体系中TrkAICD、p75NTRICD及RanBPM均能够与snapin相互作用，并且体内的免疫共沉淀和免疫杂交实验证明了TrkAICD能够与snapin相互作用。 通过以上的研究，我们为神经细胞中信号的传导打下了良好的基础，为更好的研究神经信号的传导中TrkA与p75NTR受体的功能提供了有益的线索；并且为更深入1的研究神经递质的释放打下了基础。

目录

论文说明：缩略语表

前 言

材料与方法

一、材料

(一)分子克隆相关的试剂和材料

(二)酵母双杂交实验所需试剂

(三)GSTpull down、免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation、Co-IP)所需试剂

(四)抗体制备及蛋白检测所需试剂及动物

(五)主要仪器与设备

(六)常用缓冲液的配制

二、实验方法

(一)分子克隆技术所用的实验方法

(二)酵母双杂筛选相互作用的蛋白所应用的方法

(三)融合蛋白在原核细胞中的表达与纯化

(四)抗血清的制备与纯化

(五)细胞培养与转染

(六)GST pull down实验

(七)蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western blot

(八)免疫共沉淀

(九)荧光共振能量转移(FRET)

(十)质谱检测免疫复合物

(十一)DNA序列分析软件

实验结果

(一)TrkA与RanBPM相互作用的研究

(二)TrkA与RanBPM相互作用的定位

(三)TrkA-RanBPM-p75免疫复合物的研究

(四)TrkA、RanBPM、p75与snapin相互作用的研究

(五)RanBPM抗血清的制备

(六)RanBPM在细胞系中的表达情况及在细胞中的定位

讨论

小 结

参考文献

论文综述 神经营养素受体与信号传导

致 谢

个人简历