大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌产超广谱β-内酰胺酶的表型、基因型和水解特性研究

摘要

大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌是医院感染常见的革兰氏阴性杆菌，第三代头孢菌素的广泛使用使细菌对这些药物产生了耐药，产生超广谱β-内酰胺酶(Extended-spectrumβ-lactamases，ESBLs)是革兰氏阴性菌对第三代头孢菌素耐药的主要原因。自1983年首次报道发现第一个ESBLsTEM-3后，ESBLs的流行日益严重，世界各地均有报道，且数量和基因型不断增加。ESBLs通常为质粒介导，同一质粒可同时携带多个耐药基因，引起多重耐药。最常见的ESBLs由TEM-1、2和SHV突变而来。TEM和SHV型酶种类多，地域分布广，主要由克雷伯氏菌属和大肠埃希菌产生，它们大部分是头孢他啶酶，少部分是头孢噻肟酶。其次还有头孢他啶酶PER、VEB、TLA-1、GES/IBC和头孢噻肟酶CTX-M(Toho)、SFO-1、BES-1等。本研究以大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌作为主要的研究对象，以三个常见的基因型TEM型、SHV型和CTX-M型为检测对象，鉴定两种细菌产ESBLs的情况，同时探讨ESBLs对临床常用的头孢他啶、头孢噻肟、头孢呋辛和头孢哌酮的耐药性和水解性的关系，对进一步认识超广谱β-内酰胺酶和临床合理使用抗生素有指导意义。 第一部分研究中，通过对近两年(2004-2005)北京地区医院收集到的共295株大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌，进行产ESBLs菌株表型鉴定、PCR检测基因型、等电聚焦电泳鉴定等电点和测序，并对这些菌株耐药的特性和基因型进行了探讨。表型鉴定发现：ESBLs的检出率为18.6％，其中大肠埃希菌的检出率为27.7％，肺炎克雷伯杆菌的检出率为8.57％。大部分产ESBLs肺炎克雷伯杆菌对头孢噻肟耐药，占66.7％，但对头孢他啶耐药仅占33.3％。大部分产ESBLs大肠埃希菌对头孢噻肟和头孢他啶均耐药，分别占46.5％和58.1％。 耐药基因型鉴定发现：引起耐药的基因型主要为TEM型81.8％(45/55)，其次CTX-M型74.5％(41/55)，然后是SHV型20％(11/55)。大肠埃希菌以TEM型为主(88.4％)，其次CTX-M型(67.4％)，43株中仅检测到2株产SHV型(4.65％)；肺炎克雷伯杆菌以CTX-M为主(91.7％)，其次是SHV型(75％)和TEM型(58.3％)。在本实验中检测到产2种基因型以上的细菌占70.9％(39/55)，大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌分别为67.4％和83.3％。实验中未检测到CTX-M-2型酶。经等电聚焦电泳验证，少数菌株的耐药由TEM、SHV、CTX型酶之外的ESBLs引起。结合MIC、基因型和等电点，对单个菌株的耐药性质进行分析发现：只产单个CTX-M型酶的菌株对头孢噻肟的耐药性强于头孢他啶，大肠埃希菌5-19只产一个TEM型酶，此TEM型ESBL是头孢他啶酶。 肺炎克雷伯杆菌4-62的TEM型酶的DNA序列与TEM-1DNA序列同源性为99.6％，翻译后的氨基酸序列与TEM-1同源性为97.4％。 第二部分研究中采用了分光光度法测定水解率，并对该方法进行了方法学的探讨。结果表明，对标准β-内酰胺酶和临床分离菌产酶，头孢他啶稳定性优于头孢噻肟、头孢哌酮和头孢呋辛，它们的平均水解率分别为，广谱酶：1.5％、8.3％、52.9％、18.5％；ESBLs：35.1％、39.9％、49.9％、39.5％。大肠埃希菌：7.8％、38.0％、48.0％、32.6％；肺炎克雷伯杆菌：18.7％、40.6％、57.1％、30.7％。 通过检测相对抑酶保护率，对酶抑制剂的抑酶效应进行比较。由标准酶介导的水解，他唑巴坦和舒巴坦保护作用相似，头孢呋辛/酶抑制剂从16∶1到1∶1的平均相对保护率分别为48％～71％和45％～67％。由临床分离菌产酶介导的水解，他唑巴坦(大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌平均相对保护率分别为43％～87％和43％～80％)对头孢呋辛的水解保护作用强于舒巴坦(大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌平均相对保护率分别为18％～42％和2％～20％)。

目录

英文缩略语表

图表索引

前言

第一部分大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌产超广谱β-内酰胺酶表型和基因型的研究

1材料与方法

2.结果

3讨论

第二部分ESBLs水解特性的研究

小结

参考文献

文献综述 超广谱β-内酰胺酶的分子生物学研究进展

发表文章

致谢

附图