κ阿片受体激动剂U50488对未分化PC12细胞钾通道的调节作用及其机理的初步探讨

摘要

阿片受体是指能够与内源阿片肽或麻醉药及其特异的拮抗药呈特异结合的七次跨膜受体，是G蛋白偶联受体家族的成员。研究发现，阿片受体可以分为多种亚型。其中μ、δ和κ亚型在中枢神经系统中表达很高，介导了阿片类药物的中枢镇痛作用。 我们采用膜片钳全细胞和单通道记录法，研究PC12细胞外向和内向钾电流的特征，以及κ-阿片受体激动剂U50488对外向钾电流的调节作用。进而在分子和细胞水平上初步探讨了U50488抑制外向整流钾通道的机制。 主要结果如下：未分化PC12细胞外向整流钾通道的特性：应用膜片钳全细胞记录、单通道记录和穿孔膜片钳记录法观察到未分化PC12细胞上广泛分布的外向钾电流，快速激活并且不容易失活，具有电压依赖和外向整流特性。该通道电流可被TEA阻断，造成半数激活电压升高，激活斜率因子降低。瞬时外向钾电流阻断剂4-AP和ATP敏感的钾通道阻断剂tolbutamide不能阻断该通道全细胞电流。单通道记录结果显示未分化PC12外向钾通道电导为74.87±7.78pS，通道成簇状开放且具有电压依赖性。开放概率随刺激电压绝对值的增加而增加。虽然不止一种开放幅度，但从单一的开放时程来看属于同一通道。最大似然拟合分析平均关闭时得到三种关闭时程：长时程(239ms)、中时程(26.68ms)、短时程(1.069ms)关闭。这种单通道电流也能被TEA阻断。 U50488对PC12细胞外向整流钾通道的调节吗啡和DAMGO对外向整流钾电流影响不明显；DPDPE能增强外向整流钾电流；而κ阿片受体激动剂U5048810-6M明显的抑制外向整流钾电流，60mV的抑制率达30.39±6.58％。U50488抑制作用呈剂量依赖和时间依赖关系。其长期孵育(24hr、48hr)亦对外向整流钾通道有明显抑制作用。 U50488同时也改变了通道动力学过程，对于全细胞记录，加入U50488后稳态激活曲线斜率因子为36.8+4.3mV(n=7)，小于给药前；而40mV和60mV通道激活时间常数平均值分别为0.1±2.3ms和3.9±0.6ms(n=9)，相比给药前有所升高，这说明U50488瞬时作用可以减慢PC12细胞外向整流钾通道的开启速度。 对单通道记录，动力学分析发现U50488作用分为两个阶段：第一阶段，瞬时作用，通道表现出时开时闭的不稳定闪烁状态，平均振幅和开放时没有显著性改变，而关闭时改变较明显，具体表现为短时程关闭(0.9499ms)比重迅速增多(76.2％)，长时程关闭(249.5ms)比重迅速减小(2.2％)。第二阶段，长时间(3min)作用，主要表现为通道关闭，开放时虽然没有显著性改变，但是平均振幅比对照组有显著性降低，关闭时也发生明显改变，具体表现为短时程关闭(2.034ms)比重迅速降低(38.8％)，长时程关闭(301.9ms)比重迅速升高(61.2％)。 U50488对PC12细胞外向整流钾通道的调节机制探讨U50488对外向整流钾通道的时间依赖、浓度依赖的抑制作用，能被阿片受体拮抗剂纳洛酮所阻断，纳洛酮本身对该通道没有激活作用。导致阿片受体与G蛋白脱偶联的百日咳毒素(PTX)和难水解的GDP衍生物GDPβS均阻断了U50488对外向整流钾通道的抑制作用。同时拮抗了U50488对全细胞通道动力学的改变。而非水解的GTP类似物GTPγS和霍乱毒素(CTX)不能影响U50488对该钾通道的抑制率。 过量cAMP缓冲具有双向调节PC12外向整流钾通道的作用，指令电压在60mV以下表现为轻微抑制效应，在60mV以上表现为兴奋作用。过量cAMP不能拮抗U50488对该外向钾通道的抑制效应(包括动力学的改变)。腺苷酸环化酶激活剂forskolin、GppNHp和磷酸二酯酶(PDE)抑制剂IBMX表现出与cAMP相似的作用，且PKA的拮抗剂Rp-cAMP也不能拮抗U50488的抑制作用。 cAMP水解产物5-AMP、PDE激活剂calmodulin和钙库耗竭剂thapsigargin则都表现出抑制PC12外向整流钾通道的特性。 U50488对MCF-7和κ-HEK293细胞外向整流钾通道的调节在文献报道表达有κ阿片受体的MCF-7细胞上，记录到TEA敏感的电压依赖的钟通道。该通道可被阿片受体激动剂(DAMGO、DPDPE和U50488)激活，U50488对通道的兴奋作用具有浓度依赖性，可部分被纳洛酮阻断。单通道的记录也证实了这一发现。此外，U50488激活后的钾通道激活速度快，失活也很快，通道失活程度与刺激时间和刺激间隔密切相关。 在稳定表达κ阿片受体的HEK293细胞上记录到内源性外向钾通道，具有电压依赖性。U50488能够兴奋这一通道。 U50488对PC12细胞内向整流钾通道的调节采用单通道、全细胞记录方式，记录到未分化PC12细胞上存在内向的钾电流，其单通道电导为50.26±19.01pS，可被CsCl阻断。加入κ阿片受体激动剂U50488后PC12细胞单通道电导降为39.77±18.33pS，但是平均开放时、关闭时和开放概率均没有显著改变。U50488对该电导的抑制作用具有浓度依赖性，且能被纳洛酮阻断。 U50488对κ-HEK293细胞内向整流钾通道的调节记录到κ-HEK293上内向整流的全细胞和单通道钾电流。U50488抑制该通道的开放，其作用过程可分为两相：第一相，瞬时作用，仅表现为电导的降低，通道开放时、关闭时及开放概率变化不明显。第二相，长时间作用(3min)，电导进一步降低，而开放概率却显著升高。 综合以上结果表明，未分化的PC12、MCF-7和κ-HEK293细胞都有外向整流钾通道。U50488兴奋后两株细胞上的外向钾通道，却抑制PC12上外向钾通道。该抑制效应可能通过κ阿片受体—Gi/o通路跨膜传递信号，但不经过cAMP-PKA途径起作用，猜测可能与Ca2+-calmodulin-PDE-5-AMP通路有关。另外PC12和κ-HEK293细胞上还存在可被U50488抑制的内向钾通道，其抑制机理有待进一步研究。

目录

摘 要

英文缩略词表

前 言

实验材料

实验方法

实验结果

第一部分U50488对未分化PC12细胞外向整流钾通道的作用机制研究

一、外向整流钾通道的通道特性研究：

二、κ阿片受体激动剂U50488对PC12外向整流钾通道的调节作用

三、U50488对PC12外向整流钾通道调节机理的初步探讨

四、U50488对MCF-7和κ-HEK293细胞电压依赖钾电流的作用

第二部分U50488对未分化PC12细胞和κ-HEK293细胞内向整流钾通道的调节

讨论

小 结

参考文献

钾通道与阿片镇痛(综述)

个人简历

致 谢