木豆叶提取物对雌激素缺乏性骨丢失的影响

摘要

目的：观察木豆叶提取物对去卵巢骨质疏松模型大鼠，HOS-TE85成骨细胞功能，矿化及破骨细胞分化的影响，从而探讨植物雌激素木豆叶提取物对更年期由于雌激素缺乏引起的骨质疏松的抑制作用。 方法：1)动物实验：雌性Wistar大鼠60只，体重232.7±11.0g。去除成年雌性大鼠双侧卵巢造成骨丢失型骨质疏松模型。动物分成6组：①假手术对照组(n=8)；②骨质疏松模型组；③雌二醇组(0.5mg/kg)；④木豆叶提取物32-1低剂量组(50mg/kg)；⑤木豆叶提取物32-1中剂量组(100mg/kg)；⑥木豆叶提取物32-1高剂量组(200mg/kg)。假手术组和模型组大鼠给予去离子水1ml/100g体重。大鼠卵巢切除两周后，开始给予木豆叶提取物或雌二醇或去离子水，灌胃1次/天，6天/周，连续8周。测定指标：体重、子宫重量和血清激素水平、骨病理切片检查，HE染色法观察股骨病理改变(骨小梁结构改变)。 2)细胞实验：Ⅰ木豆叶对HOS-TE85成骨细胞功能的影响：将细胞种于板中，第二天加药，E2(10-9M)，木豆叶提取物(10-7，10-8，10-9g/ml)药物处理48h后，分别观察以下指标①细胞增殖(MTT)；②3H-脯氨酸掺入；③碱性磷酸酶活性。 Ⅱ木豆叶(10-8g/ml)长时程作用HOSTE85成骨细胞18天后，去培养基，用福尔马林/甲醇/水固定。茜素红(AlizarinRedS，PH4.0)染色，用去离子水洗，晾干。显微镜下观察照相。茜素红染色以观察木豆叶对成骨细胞间质矿化的影响。 Ⅲ木豆叶对破骨细胞形成的影响：处死大鼠，无菌下取股骨分离周围组织，切断股骨两端骨骺，D-Hanks冲洗骨髓腔，收集冲洗液，离心，加入预先配好的培养体系DMEM诱导培养基[20％FCS，1.25ng/mlGM-CSF，10-8M1,25(OH)2VD3.]分别加入E2(10-9M)，2木豆叶(10-7，10-8，10-9g/ml)观察每天细胞被诱导情况。6天后进行抗酒石酸酸性磷酸酶TRAP染色，照相，并进行破骨细胞计数(以TRAP阳性，胞核3个以上为标准)，观察药物对破骨细胞分化的影响。 结果：1)动物实验：①体重与子宫重量变化：造模后，大鼠体重明显增加。给予雌二醇和木豆叶提取物大鼠体重较模型组略有降低。模型组子宫重量仅是假手术组的20％。而给予雌二醇后，大鼠子宫重量增加了108.3％。木豆叶各剂量组大鼠的子宫重量没有明显增加(表6)；②激素水平变化：大鼠卵巢切除后，血清雌二醇含量明显下降，FSH和LH则明显增加。而给予雌二醇后，血清雌二醇含量增加57.7％，FSH降低11.5％，LH降低20.7％。木豆叶高剂量组血清雌二醇含量没有明显增加，FSH和LH则分别降低11.5％和15.2％。本实验结果表明，木豆叶改善由于血清雌激素水平降低所引起的FSH和LH的升高(表7)，具有雌激素样作用；③骨小梁：去卵巢后，大鼠的股骨无一例外的出现骨丢失，表现为骨小梁变细，期间连接较少，小梁间隙增大，面积减少。补充雌二醇后，有82％大鼠股骨的骨丢失得到了恢复。木豆叶提取物高剂量组大鼠则有60％的股骨的骨丢失得到改善，中剂量组30％骨丢失有所改善(表8和图4)。表现为，木豆叶提取物高剂量组：骨小梁无明显变细，且排列较整齐，连接成网，局部区域骨小梁间隙略增大，骨小梁面积均未见减少。雌二醇组：骨小梁无明显变细，排列整齐，骨小梁面积无明显减少。2)细胞实验：Ⅰ对HOSTE85成骨细胞的影响：①细胞增殖(MTT)：木豆叶提取物，48小时作用成骨细胞，No.29-1，30，32-1，35-1，35-2，35-3，Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅵ号成分可剂量依赖的促进细胞的增殖，细胞数量较对照组增加23％-73％；②3H-脯氨酸掺入：No.29-1，29-2，30，31-1，31-2，32-1，35-2，35-3，Ⅱ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ号成分均能促进3H-脯氨酸掺入。其中，化合物No.31-2，32-1作用下，掺入量增加128％。脯氨酸是胶原蛋白形成的必要氨基酸之一。脯氨酸掺入量的增加说明木豆叶提取物刺激细胞胶原蛋白形成；③碱性磷酸酶活性：No.35-1，35-3，Ⅱ，3Ⅲ，Ⅵ号成分对碱性磷酸酶的活性有增强作用，P＜0.01。碱性磷酸酶是骨形成所必需的酶。实验结果说明木豆叶可促进成骨细胞的功能。(见表1，2，3)。 Ⅱ木豆叶提取物No.31-1，31-2，32-1，35-3对成骨细胞18天作用后，矿化面积明显增大，说明这些木豆叶成分的长时程(18天)作用对HOSTE85成骨细胞的矿化起着明显的促进。矿化面积的增大是木豆叶提取物促进成骨细胞增殖，胶原蛋白形成，增加碱性磷酸酶活性，细胞成熟，以及进一步促进问质矿化共同作用的结果。 Ⅲ木豆叶对破骨细胞形成的影响：细胞接种后，于倒置显微镜下观察，第6天，破骨细胞形成最多，细胞形状为圆形，椭圆形，梭形，及不规则形状，胞核达3～6个，有的出现伪足。酸性磷酸酶染色后，破骨细胞计数。可见升麻苷，32-1，35-1，Ⅱ，Ⅳ，Ⅴ在10-8g/ml时抑制率均在20％以上。No.29-2，31-1，31-2在10-7g/ml药物浓度时抑制率均在20％以上。可见，木豆叶提取物对破骨细胞生成的具有抑制作用，从而抑制骨质疏松(表4，5)。 结论：从以上体内、体外实验结果可以看出，木豆叶提取物No.32-1在不影响血清雌激素水平、不刺激子宫增生的情况下，明显改善大鼠股骨的骨丢失，降低血清FSH和LH含量。其作用机理与其刺激成骨细胞的功能，矿化以及抑制破骨细胞形成有关。另外，其他编号木豆叶提取物的细胞药物筛选实验也明显反映出它们增强成骨细胞功能和抑制破骨细胞分化的作用。

目录

缩略语表

引言

第一部分细胞实验

第二部分动物实验

参考文献

文献综述：植物雌激素研究进展

阿尔采末病非人灵长类动物模型

Estrogenic extracts from Cajanus Cajan L.ameliorate ovariectomy-induced bone loss

致谢