人胸腺素β4在大肠杆菌中的克隆、表达、纯化及生物学活性鉴定

摘要

胸腺素β4是胸腺素的有效组分之一，为1981年Low等人从小牛胸腺中提取分离纯化的，高度保守，由43个氨基酸组成，N端丝氨酸被乙酰化，等电点为5.1，具有免疫调节的功能，是一种在多种组织均有表达的蛋白多肽，在体液，血液中均存在。大量的研究表明胸腺素B4能够诱导内皮细胞分化，促进血管生成，并能促进创伤的愈合和心肌梗塞时心肌细胞的存活和血管生成。胸腺素β4在治疗皮肤、角膜创伤，治疗心肌梗塞，抗肿瘤治疗，抗炎等方面有着广阔的应用前景，目前胸腺素β4在治疗创伤、心肌梗塞等方面已经进入临床试验。由于天然状态下胸腺素β4含量稀少，从组织中纯化它的成本较高；化学合成方法可以获得，但是价格昂贵。因此，本文利用基因工程技术对胸腺素β4在大肠杆菌中的表达进行了研究，以期为进一步研究其生物学功能奠定基础。 (一)人胸腺素β4在原核系统中的克隆、表达及纯化首先按照大肠杆菌密码子嗜性对人胸腺素β4的基因序列进行改造，用化学法合成人胸腺素β4全基因序列，PCR方法扩增人胸腺素β4基因并在其两端引入Nde I和Xho I限制性酶切位点。将PCR扩增产物克隆至pGEM-T载体，转化DH5a，抽提质粒，测序鉴定，把序列正确质粒上的胸腺素β4基因亚克隆至原核表达载体pTXB1，转化大肠杆菌ER2566，在IPTG诱导表达，表达的融合蛋白约占菌体蛋白总量的50％，经过超声裂解，亲和层析，柱上裂解释放目的蛋白，超滤，脱盐等处理得到重组人胸腺素β4纯品。纯化的胸腺素β4经Tricine-SDS-PAGE电泳分析只有一条带，纯度在90％以上。 (二)人胸腺素β4蛋白理化特性的研究用Edman降解法对重组人胸腺素β4纯品N端5个氨基酸测定，测序结果显示重组蛋白的N端5个氨基酸为SDKPD，与天然胸腺素β4的一致；用ABI公司质谱仪对重组蛋白分析，分析结果显示重组蛋白具有预期的分子量，胰蛋白酶酶切肽谱测定结果显示肽质量图谱匹配良好，这些结果表明重组蛋白就是人胸腺素β4。 (三)人胸腺素β4生物学活性检测人胸腺素β4具有免疫调节的作用。参照相关文献，用淋巴细胞转化试验来检测重组蛋白的生物学活性。本研究首先优化了刀豆素A的最佳刺激浓度，选用终浓度4ug/ml的刀豆素A刺激淋巴细胞6小时，然后加入不同浓度的重组人胸腺素β4继续培养至72小时，用MTT法检测细胞的增殖。与化学合成的人胸腺素β4相比，重组人胸腺素β4具有相当的生物学活性。 (四)人胸腺素β4在创伤愈合中的促进作用参照相关文献，在Balb/c小鼠身上制造皮肤创伤模型，局部使用重组人胸腺素β4，组织学检测表明重组人胸腺素β4能够促进创伤区域表皮细胞的迁移，促进血管的生成和胶原的沉积。因此本文表达纯化方法制备的重组人胸腺素β4具有促进皮肤创伤愈合的作用。

目录

论文说明：缩写

摘要

前 言

第一部分 人胸腺素β4在大肠杆菌中的克隆、表达与纯化

实验材料

实验方法

实验结果

讨 论

第二部分 重组人胸腺素β4的理化特性鉴定和活性测定

实验材料

实验方法

实验结果

讨 论

第三部分 重组人胸腺素β4在小鼠皮肤创伤愈合过程中的作用

实验材料

实验方法

实验结果

讨 论

论文总结及创新点

参考文献：

综述 胸腺素β4研究状况及进展

致 谢