MEKK1与胰腺癌发生发展的关系研究;Icogenin体外抗胰腺癌作用及其机制研究

摘要

胰腺癌是一种消化系统恶性肿瘤，据2002年全球癌症统计，胰腺癌的发病率占第11位，而死亡率却已经上升至第8位。死亡率高的主要原因与胰腺癌恶性度高，诊断时大多数患者已经到了晚期，肿瘤过大(直径大于4cm)、浸润到周围脏器或者已经发生了淋巴转移。胰腺癌复发率高，即使进行了手术也预后极差。因此，寻找与胰腺癌发生发展密切相关的特异基因或蛋白具有重要意义。 目前研究表明，胰腺癌的组织和细胞已有许多基因发生了突变，比如VEGF、EGF、Notch、IGF、MUC、K—Ras、PI3K—AKT和sonic hedgehog等。这些突变因子主要归属于3条重要信号转导通路：Ras—MAPK信号转导通路、PI3K—AKT—mTOR信号转导通路和Hedgehog信号转导通路。K—ras基因在胰腺癌患者中的突变率高达90％以上，突变的k—ras基因导致Ras蛋白的持续激活，激活的Ras蛋白自身磷酸化并激活其下游蛋白，包括Ras—MAPK信号转导通路中的一个重要结点——MEKK1也被激活。 MEKK1是MAP/ERKKK1激酶的缩写，属于MAPKKK家族的成员，在MAPK信号通路中处于结点位置，也是MAPK通路与其他信号通路的结点，包括IKK—NFκB通路、JAK—STAT通路和GSK3p通路。MEKK1具有重要的生物学功能，如影响细胞的存活和凋亡，参与肿瘤细胞的运动和迁移，据文献报道与胃癌、乳腺癌和卵巢癌的侵袭密切相关。全长的MEKK1是196kD的蛋白，可与许多蛋白都发生相互作用，如骨架蛋白、丝氨酸/苏氨酸激酶和粘着斑相关的酪氨酸激酶(FAK)等。活化的MEKK1又可激活其下游的JNK通路、P38通路和ERK信号转导通路。 为探索MEKK1在胰腺癌发生发展中的作用，本研究首先采用RT-PCR方法对不同组织来源的肿瘤细胞株及正常细胞株中MEKK1的mRNA表达水平进行了检测，结果2株胰腺癌细胞BxPC3和Capan2均呈高表达。随后，将胰腺癌细胞系增加到4株(BxPC3、Capan2、SW1990和PANC1)，并运用多种方法对MEKK1的表达水平进行了检测。如运用RT-PCR检测了mRNA水平的表达差异，采用Western Blot和免疫荧光方法检测了蛋白水平的表达差异。结果MEKK1在BxPC3细胞株中表达水平最高，Capan2的表达水平其次，SW1990和PANC1表达水平均较低。同时也采用RT-PCR方法检测了4株胰腺癌MEKK2、MEKK3和MEKK4的mRNA表达水平，结果MEKK4在4株胰腺癌细胞系的表达模式与MEKK1相似。 为探讨MEKK1与胰腺癌细胞生物行为之间的关系，对4株胰腺癌细胞株的生物学行为进行了检测。采用软琼脂集落方法检测其恶性度，划痕愈合实验检测其运动能力，粘附实验检测其异质粘附特性，Transwell方法检测其侵袭能力。结果表明，4株胰腺癌细胞中BxPC3细胞的粘附、侵袭、转移能力和恶性度都为最高，粘附、侵袭和转移能力的变化趋势与MEKK1的表达水平相一致。因此推测胰腺癌细胞的生物学特性可能与MEKK1和/或MEKK4的高表达有关。 为进一步探讨MEKK1是否与胰腺癌的侵袭转移能力呈正相关，本文以MEKK1表达水平最高和侵袭转移能力最强的BxPC3细胞作为研究对象，采用RNA干扰技术对MEKK1基因进行沉默，检测沉默后该细胞的运动、粘附、侵袭、转移以及分泌MMP的能力。结果表明，MEKK1基因沉默后，BxPC3细胞的运动、粘附、侵袭、转移以及分泌MMP2的能力均低于未转染和转染阴性对照siRNA的BxPC3细胞(P<0.05)。 MEKK1的下游信号转导通路主要有ERK通路、JNK通路和P38通路。MEKK1的哪条下游通路在胰腺癌的侵袭转移中起主要作用尚不清楚，为此检测了MEKK1沉默后其下游蛋白ERK、JNK和P38磷酸化与非磷酸化水平。结果只有磷酸化ERK的表达水平明显下降，而磷酸化的JNK和p38只为轻度抑制。提示MEKK1参与胰腺癌的侵袭转移主要通过ERK信号转导通路实现。 为进一步探讨MEKK1在人胰腺癌发生发展中的作用，与哈尔滨医科大学附属医院合作，对2001年到2006年的41例胰腺癌患者的组织标本进行了回顾性分析。采用组织化学方法检测了组织标本中的MEKK1蛋白表达，结合患者病理特征进行了分析。结果表明，MEKK1阳性例数有32例(占78.1％)，MEKK1表达与淋巴转移、TNM分级和肿瘤分化程度高度相关(P<0.01)，而与患者的年龄、性别、肿瘤大小和肿瘤发生部位等不相关(P>0.05)。MEKK1的蛋白表达主要位于胞浆，但随着分化程度的不同，其细胞定位有所改变，高分化癌的细胞核中几乎没有表达，中分化癌细胞核中表达增加，而低分化癌细胞核中全部都有表达。ERK的蛋白表达也与MEKK1呈正相关。提示MEKK1蛋白在细胞核中的表达与分化程度密切相关，且在胰腺癌的侵袭转移过程中起一定的作用，并且与ERK高度相关。 综上所述，MEKK1的蛋白高表达与胰腺癌的侵袭转移有关，并且与其下游基因ERK高度相关，MEKK1很可能成为治疗胰腺癌的潜在分子靶点。 Icogenin是由中国医学科学院药物研究所化学合成室雷平生研究员课题组从龙血树(Dracaena draco)中提取的一种甾体皂苷，具有一定的细胞毒作用。前期MTT筛选实验研究发现，Icogenin对胰腺癌PANC1细胞和人鳞状上皮癌A431细胞的生长抑制作用最强。目前临床上治疗胰腺癌最理想的办法仍是外科根治手术加药物化疗，对于不能手术或进行姑息性手术的患者，化疗则更为重要，而细胞毒性药物在目前临床实施的化疗方案中仍占主导地位，因此研究Icogenin的抗胰腺癌作用及其作用机制则具有重要意义。 本研究采用人胰腺癌细胞株BxPC3作为体外细胞研究对象，MTT方法测得Icogenin的IC50为0.84±0.10μmol/L，但斜率较陡。5μmol/L Icogenin可明显地抑制BxPC3细胞生长和集落形成，使BxPC3细胞阻滞在G2/M期，Icogenin作用6h即可诱导BxPC3细胞出现凋亡，细胞内核小体DNA断裂出现典型的梯形条带。同时流式细胞术、AO/EB染色等多种方法均证实了细胞凋亡的存在。Western blot结果表明，Icogenin诱导BxPC3细胞凋亡主要与抑制线粒体通路的bcl—2家族有关(Bax、bcl—xl、Bak、bcl—2等均有变化)，而与P53无关。诱导凋亡剂量对于MAPK信号通路的影响则是磷酸化的ERK和P38蛋白表达水平降低，而磷酸化的JNK蛋白表达水平增加。 体外实验还发现在低于凋亡剂量(1μmol/L小于48h的IC10)的Icogenin还具有抗胰腺癌侵袭转移作用。研究中分别采用穿膜方法、粘附实验和单层细胞划痕实验探讨Icogenin对胰腺癌BxPC3细胞侵袭、粘附和运动能力的影响。Western blot方法检测Icogenin对MAPK信号传导通路蛋白表达水平的影响，明胶酶谱法分析Icogenin对MMP2分泌的影响。结果表明，Icogenin在体外可显著抑制人胰腺癌BxPC3细胞的侵袭、运动以及粘附能力(P<0.05)，并呈较好的剂量依赖关系，ERK抑制剂PD98059和U0126也可抑制BxPC3细胞的侵袭和转移能力。Icogenin可抑制MMP2的分泌，其作用机制与抑制MAPK信号传导通路中的磷酸化ERK有关。 说明Icogenin对胰腺癌细胞具有一定的抗侵袭转移作用，大剂量可通过线粒体通路诱导细胞出现凋亡而起到抗胰腺癌作用。

目录

论文说明：英文缩略词

声明

第一部分 MEKK1与胰腺癌发生发展关系研究

前言

实验材料

1药品和试剂

2细胞株

3溶液配制

4主要仪器

实验方法

1细胞培养

2 RT-PCR及基因表达分析

3 Western Blot杂交分析蛋白表达

4免疫荧光检测靶蛋白

5肿瘤克隆原细胞集落形成能力测定(软琼脂集落法)

6划痕-愈合分析实验

7重组基质膜侵袭实验

8肿瘤细胞与基底膜成分的粘附能力测定

9 RNA干扰实验

10人胰腺癌标本的免疫组织化学检测

11统计学分析

实验结果

1 MEKK1在不同组织来源的肿瘤细胞株中mRNA和蛋白表达水平

2 4株胰腺癌细胞株的生物学行为研究

3 si-MEKK1干扰胰腺癌BxPC3细胞后对生物学行为的影响

4人胰腺癌组织标本MEKK1的蛋白表达及与病理特征之间的关系研究

讨论

结论

第二部分Icogenin体外抗胰腺癌作用及其机制研究

前言

材料和方法

结果

1 Icogenin对肿瘤细胞生长的抑制作用

2 Icogenin对BxPC3细胞凋亡的影响

3 Icogenin对BxPC3细胞侵袭转移能力的影响

讨论

结论

综述 MEKKI在肿瘤MAPK信号传导通路中的作用

参考文献

致谢

个人简历