2型糖尿病患者胆固醇外流的功能改变及机制研究

摘要

2型糖尿病患者动脉粥样硬化心脑血管疾病的发病率远远高于非2型糖尿病患者，其存在多重致动脉粥样硬化因素，其中高密度脂蛋白(HDL)数量及其介导的胆固醇逆转运功能异常在糖尿病动脉粥样硬化发展过程中发挥了重要作用。巨噬细胞胆固醇外流是胆固醇逆转运过程中的重要的初始步骤，本研究主要就胆固醇外流功能在2型糖尿病患者中的异常调节进行探讨。
　　 研究目的：
　　 1.探讨不同人群外周血单核巨噬细胞ABCA1、ABCG1的mRNA及蛋白的表达情况。
　　 2.通过以HDL、ApoA1及血清为接受体，研究不同人群单核巨噬细胞的胆固醇外流功能。
　　 3.研究不同人群单核巨噬细胞的核因子肝X受体(LXR)的mRNA表达，同时通过电泳迁移率试验探讨LXR对ABCG1基因转录的调控作用。
　　 方法：
　　 1.按WHO诊断标准选取单纯2型糖尿病和2型糖尿病合并冠心病患者，同时选取年龄与性别匹配的健康人群作为及正常对照组，抽取外周静脉血40ml，进行血脂、血糖等生化指标的检测，ELISA血游离脂肪酸(FFA)水平。
　　 2.Ficoll密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞(PBMC)，免疫磁珠法分选单核细胞，M-CSF刺激培养使单核细胞巨噬化。油红0及CD68免疫组化染色鉴定巨噬细胞。
　　 3.Real-TimePCR方法检测人单核巨噬细胞上ABCA1、ABCG1的mRNA表达。
　　 4.WesternBlot方法检测人单核巨噬细胞上的ABCA1和ABCG1的蛋白表达。
　　 5.H3胆固醇标记巨噬细胞，以HDL为接受体，观察以BLT-1阻断SR-B1通路后经ABCG1通路的胆固醇外流；以apoAl为接受体，观察经ABCA1通路的胆固醇外流；并以患者的自身血清和标准血清为接受体，观察患者血清介导巨噬细胞的胆固醇外流能力的变化。
　　 6.用Real-TimePCR检测核因子LXRα、LXRβ的mRNA表达水平。
　　 7.电泳迁移率试验(EMSA)检测LXR与ABCG1启动子区地LXRE结合的DNA结合蛋白的表达，从而探索LXR对ABCG1转录的影响。
　　 8.统计分析:采用SPSS13.0软件进行统计分析，计量资料以X±SD表示，组间比较以one-wayANOVA进行分析，线性相关应用Pearson's相关分析，回归分析采用多重线性回归分析方法。
　　 结果：
　　 1.受试者一般特征及生化指标概括:包括正常对照组15例，单纯糖尿病组15例，糖尿病合并冠心病组15例，共45例。单纯糖尿病组与糖尿病合并冠心病组患者的空腹血糖水平显著高于对照组，HbAlc水平高于正常值；单纯糖尿病HDL-C、Hs-CRP低于正常对照组，余指标在各组间无显著差异。
　　 2.Real-TimePCR检测结果发现2型糖尿病患者ABCG1的mRNA表达水平显著下调(2.26±0，86vs0.83±0.26，P<0.001)，而ABCA1的表达则无显著改变(2.36±3.20vs2.34±2.88，P=0.98)。ABCG1mRNA表达的多重线性回归分析显示:HbAlc与ABCG1的mRNA表达呈线性回归关系，ABCG1的mRNA表达与HbAlc水平呈显著负相关(r=-0.057，P=0.038)，HbAlc可能为ABCG1表达的重要影响因素。
　　 3.WesternBlot检测结果发现2型糖尿病患者的ABCG1的蛋白表达水平也显著下降，而ABCA1的蛋白表达在各组之间无显著差异存在。
　　 4.HDL介导的经ABCG1通路的胆同醇外流率及自身血清和标准血清介导的巨噬细胞胆固醇外流率在2型糖尿病患者中均显著下降(P均<0.01)；而ApoA1介导的经ABCA1通路的胆固醇外流率在单纯2型糖尿病患者中与对照组无明显差异(P=0.09)，在糖尿病合并冠心病组患者却显著低于正常对照组(P=0.04)。
　　 5.Real-TimePCR检测LXRa与LXRp的mRNA表达在正常对照组与2型糖尿病组之间未存在显著差异(P=0.81，P=0.63)。
　　 6.EMSA检测LXR与ABCG1启动子结合的DNA结合蛋白的表达在2型糖尿病与正常对照组之间未发现显著差异(P=0.16)。
　　 结论：
　　 1.在2型糖尿病患者中，巨噬细胞ABCG1的基因及蛋白表达显著下降，而ABCA1的基因及蛋白表达则无明显改变。
　　 2.2型糖尿病患者血清介导的巨噬细胞胆固醇外流能力明显受损，以ABCG1通路介导的胆固醇外流下降为主，ABCA1通路介导的胆固醇外流在单纯糖尿病患者中无异常，但在糖尿病合并冠心病组患者中却显著降低。
　　 3.ABCG1的mRNA表达与血清HbAlc水平呈显著负相关，HbAlc可能是影响ABCG1表达的重要因素之一。
　　 4.2型糖尿病患者ABCG1表达下调的调控机制可能以一种非依赖LXR的方式进行。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩略词表

声明

前言

实验材料

第一部分 人外周血单核细胞的分离和巨噬化培养

实验方法

试验结果

第二部分 实时定量PCR检测ABCA1、ABCG1的mRNA表达

试验方法

试验结果

第三部分 Western blot检测ABCA1和ABCG1的蛋白表达

试验方法

试验结果

第四部分 人单核细胞来源的巨噬细胞的胆固醇外流试验

试验方法

实验结果

第五部分 游离脂肪酸水平的测定与相关性分析

实验方法

实验结果

第六部分 探讨比较人单核细胞来源的巨噬细胞ABCG1表达的调控机制

实验方法

实验结果

讨论

结论

创新性及展望

局限性

参考文献

综述 2型糖尿病患者的胆固醇逆转运功能研究

致谢

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