抗膜突蛋白抗体在弥漫性结缔组织病中的研究

摘要

弥漫性结缔组织病(CTD)，作为非器官特异性自身免疫性疾病往往具有如下如下特点:患者血液中常常出现高滴度的自身抗体和(或)与自身组织成分起反应的致敏淋巴细胞；而患者体内产生的自身抗体或致敏淋巴细胞，与相应的自身组织抗原结合，通过不同的方式造成组织器官的免疫损伤和功能障碍而致病。因而，结缔组织病自身抗体反应的特异性和致病性显示其在对该疾病的诊断分类、病情评估、以及判断预后中的价值。
　　 肺脏受累是CTD常见并发症之一，多起病隐袭，早期诊断困难，并且往往治疗效果不佳，是导致CTD患者死亡的重要原因之一。其中以肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension，PAH)和间质性肺病(interstitial lung disease，ILD)为甚，目前已经成为风湿免疫科和呼吸内科医师面临的一大难题。我科既往研究应用免疫印迹法检测发现CTD-PAH患者的外周血中存在特异性抗78-kDa抗体，并且与患者雷诺现象，较长病程和PAH严重程度相关。经过蛋白组学方法分离鉴定所得特异性抗78-kDa抗体的靶抗原成分为膜突蛋白。并且在细胞水平证实人肺血管内皮细胞有膜突蛋白表达，抗膜突蛋白抗体可能通过诱导肺微血管内皮细胞早期凋亡和改变细胞骨架结构而引起细胞损伤。
　　 本项研究首次应用重组膜突蛋白作为抗原，建立检测患者外周血中抗膜突蛋白抗体的酶联免疫分析法和免疫印迹方法，并在大样本量患者群体中进行筛查，结合患者临床信息，以期探讨抗膜突蛋白抗体检测在CTD中的临床意义。
　　 目的：
　　 1.应用原核系统重组、纯化、表达膜突蛋白，并利用该蛋白建立患者外周血抗膜突蛋白抗体检测方法。
　　 2.应用酶联免疫分析法和免疫印迹法检测不同CTD患者外周血中抗膜突蛋白抗体，结合临床信息，分析抗膜突蛋白抗体检测的临床意义。
　　 3.应用酶联免疫分析法检测SSc患者外周血中抗膜突蛋白抗体，结合胸部HRCT和肺功能评估，分析抗膜突蛋白抗体与CTD相关肺脏受累之间的关系。
　　 4.应用酶联免疫分析法检测pSS患者外周血中抗膜突蛋白抗体，结合唾液腺和泪腺功能评估，分析抗膜突蛋白抗体检测在pSS中的临床意义。
　　 方法
　　 1.应用Access软件分别建立CTD-PAH，SSc患者临床观察数据库，录入患者临床资料，同时收集患者外周血标本。
　　 2.根据膜突蛋白的cDNA进行基因重组，在大肠杆菌进行蛋白表达和纯化，并以此为抗原，建立酶联免疫吸附法和免疫印迹法检测患者血清，同时对400例健康受试者群体进行筛查，确定本检测方法的cut-off值。
　　 3.应用酶联免疫吸附法和免疫印迹法对于SSc，MCTD，SLE，pSS，SV患者外周血进行抗膜突蛋白抗体筛查，结合临床资料，分析其临床意义。
　　 4.应用间接免疫荧光技术在形态学上观察pSS患者唇腺组织中膜突蛋白表达，探索患者外周血中抗膜突蛋白抗体的自身靶抗原。
　　 结果：
　　 1.应用基因重组技术，在大肠杆菌进行膜突蛋白表达和纯化，获得重组人膜突蛋白，应用该抗原建立外周血抗膜突蛋白抗体ELISA检测方法，通过对400例健康受试者进行检查，确定本方法的参考临界值为0.158。
　　 2.应用抗膜突蛋白抗体ELISA检测方法对于295例CTD患者进行抗体筛查结果示:SSc患者抗膜突蛋白抗体阳性率为52.5％，MCTD为39.5％，SLE为51.8％，pSS为69.2％，SV为22.5％，均显著高于非CTD患者阳性率(12.5％)(p<0.001％)。针对不同脏器受累分析提示:CTD相关肺脏受累(主要为PAH和ILD)组抗膜突蛋白抗体阳性率(57.0％)高于无肺脏受累组(40.8％)(P=0.018)。比较无脏器受累CTD组(33)，CTD-ILD组(32)，CTD-PAH组(14)和CTD-ILD&PAH组(14)患者抗膜突蛋白抗体检测OD均值提示:CTD-ILD＆PAH组(0.231±0.141)显著高于其他组(0.120±0.347，0.164±0.064，0.158±0.048，p=0.001)。
　　 3.抗膜突蛋白抗体检测结果与临床表现的相关性分析显示:有雷诺现象的CTD患者抗膜突蛋白抗体的阳性率(48.6％)高于无雷诺现象的患者(22.7％)(p=0.025)，抗体检测OD均值比较:CTD病程大于五年患者组(0.182±0.109)明显高于病程小于五年的患者组(0.157±0.069，p=0.050)，CTD合并重度PAH患者组(0.200±0.079)高于轻中度患者(0.158±0.057，p=0.057)。与患者的炎性指标及抗UIRNP、抗SSA抗体之间无明显相关性。
　　 4.对于入组EUSTAR的62例SSc患者进行抗膜突蛋白抗体检测结果显示:整体阳性率为37.7％，根据胸部HRCT诊断是否合并ILD提示:SSc-ILD患者的阳性率为45.2％，明显高于non-ILDSSc组(9.1％)(P=0.037)。结合PFT评估:肺功能受累组抗体OD均值显著高于无肺功能受累组。
　　 5.对于入组SICCA的83例pSS患者进行抗膜突蛋白抗体检测结果显示:唾液腺和泪腺功能受损组患者的抗膜突蛋白抗体阳性率[24(47.1％)和20(44.4％)]明显高于功能正常组患者[5(22.7％)和5(18.5％)](p=0.050和0.025)，并且抗膜突蛋白抗体与唇腺病理评分之间显著相关。
　　 6.应用单克隆抗体证实正常人唇腺上皮细胞中有膜突蛋白表达，并且pSS患者受累唇腺中膜突蛋白表达上调。同时应用患者外周血作为一抗证实抗膜突蛋白抗体的自身靶抗原为该蛋白。
　　 结论：
　　 1.外周血ELISA方法检测CTD患者抗膜突蛋白抗体阳性率显著高于非CTD患者。
　　 2.CTD不同靶器官受累的患者抗体膜突蛋白抗体阳性率不同，合并肺脏受累(主要为PAH和ILD)患者的阳性率明显增高，3.抗膜突蛋白抗体与CTD合并PAH相关，并可能预测PAH病情轻重。
　　 4.抗膜突蛋白抗体并与CTD合并ILD相关，并可能预测ILD病情轻重。
　　 5.pSS患者外周血中抗膜突蛋白抗体阳性率较高，并可能提示患者唾液腺、泪腺功能受损程度。
　　 6.膜突蛋白在正常人唇腺上皮细胞有表达，并在pSS患者唇腺上皮细胞中表达上调。pSS患者外周血中抗膜突蛋白抗体识别的自身靶抗原为该蛋白。

目录

文摘

英文文摘

前 言

第一部分：抗膜突蛋白抗体检测方法的确立

实验目的

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

第二部分：抗膜突蛋白抗体在不同结缔组织病中的筛查

实验目的

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

第三部分：抗膜突蛋白抗体检测在结缔组织病相关间质性肺病中的临床意义

实验目的

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

第四部分：抗膜突蛋白抗体检测在原发性干燥综合征中的临床意义

实验目的

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

论文参考文献

综述：膜突蛋白的结构功能及其在自身免疫病中的研究

致谢

附录